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(無題) 削除/引用 No.493-4 - 2007/11/16 (金) 11:23:29 - せい またプロでない私でごめんなさい。 1.に関して、実験について分かりませんが簡単なCell-lineの実験ならばおそらくそれぐらいでいいと思います。 また、前回聞き忘れましたがその値はハウスキーピング遺伝子などで値を補正した結果ですか？ 2.に関して、値が異なるというのは1つのPrimerでのことでしょうか？ もしそうであると、あまりに値が異なるのでPCR条件を再検討をするかPrimerを作り直して安定するものにしたほうが良いと思います。 またスタンダードは何点取っていますか？私の記憶が正しければ、スタンダードは少なくとも5点以上取らないと信頼性がでないと何かで読んだ事があります。 またPCR産物は100bpくらいになっていますか？またきれいにシングルピークになっていますか？あまり大きいと増幅効率が下がります。また、100%を超えることも良くありますが、はっきりと分かりませんが異なるものを増幅しているかスタンダードの検量がおかしいか当たりかと推測しております。 3.に関してですが、おそらく絶対定量を行う機械の設定でスタンタードの値を絶対定量での値を入れずに相対定量として使えるのでしょう。 ΔΔCT法は相対定量の中の方法の1つです。 Real-time PCR法での絶対定量・相対定量の定義は前回お話した感じです。 面倒ですが、新規でやる遺伝子については一度増幅したPCR産物をシークエンスで確認するとお勧めします。また、スタンダードですが、 プラスミドに入れるのがベストですがPCR産物をゲル抽・精製したものいでも十分使えます。 以下はある文章を引用・修正したものです。参考に。 絶対定量はコピー数の絶対量で発現レベルを決定します。相対定量は2つ以上のサンプル間での発現の変化を決定します。両方とも標準曲線と較正曲線を利用してデータを解析します。絶対定量の場合、正確な既知のテンプレート量を利用して曲線を描きます。発現定量の場合逆転写効率を考慮してそのmRNAのコピー数（量）で、増幅してからのDNA量になると相対定量になる。相対定量の場合、テンプレートは測定したいものが発現していることがわかっていればよく、必ずしもその量は必要ではありません。未知のものをどちらかの標準曲線と比較して、容量を推定します。絶対定量のための標準曲線から最終的な値を導きます。測定したいものの相対定量の較正曲線結果は同じサンプル中のハウスキーピング遺伝子の結果により標準化します。そして、標準化した値をサンプル間で比較します。

(無題) 削除/引用 No.493-3 - 2007/11/15 (木) 22:55:07 - A せいさん、早々にご回答ありがとうございました。 １ですが、３回ｘ３回もやっておりませんので、もう少しやってみます。 ２ですが、傾きは-3.5位だったり、あと-2.5位のときもあります。 -2台ですと、増幅効率が１００％以上になってしまって意味がよくわかりません。 ３ですが、概念は相対定量だと思いますが、機械上でrunするときは 検量線を書く場合は絶対定量のプレートでやらないとだめなような気がします。 相対定量のプレートはΔΔCT法の場合だったと思います。 プラスミドなどの扱いの経験がないので、濃い検体を１個つくればいいのかもしれません。 いろいろやってみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.493-2 - 2007/11/15 (木) 01:22:02 - せい 私のわかる範囲で 1.　見たいサンプルは定量性の保たれた検量線上に乗っていますか？ 具体的にCtはどれくらいですか？ また、装置の再現性を見るために同じサンプルで3回、実験の再現性を見るために実験を3回が少なくとも必要と思います。統計に詳しくないので間違っていたらごめんなさい。 以上のような方法で、平均して1/2と1/3が入れ替わった結果になったのでしょうか？ ２．検量線の傾きは増幅率100％の値になっていますか？ たしか-3.2くらいだったと思いますが。 またRは限りなく1に近い値、例えば0.999くらいに収まっていますか？ 以上のものがクリアーしていればだぶんベースラインはいじくらなくても大丈夫だと思います。指数関数増幅領域のスタンダードの幅が均等な所に合して上記に示した値になればOKとします。これも間違っていたらごめんなさい。 3.　「スタンダードとして選ぶ検体」ってのは1.での絶対定量のstudyで検量線を書いて....と同じですか？であればそれは相対定量です。 絶対定量とは、簡単にいうとインビトロでRNAを合成しRNA量を測定、それをサンプルと同じ逆転写酵素でcDNA化。それをスタンダードとして用い単位は最初に測定したRNA量で示すものを絶対定量だったと思います。 またスタンダードを基準にAはBの何倍ってやるのを相対定量というと思います。 いちいち全検体をテストするのが面倒であればあらかじめ増幅したPCR産物をスタンダードに用いればいいのではないでしょうか？

real time PCR 初心者 削除/引用 No.493-1 - 2007/11/14 (水) 21:41:26 - A real time PCR初心者の者です。 初歩的な質問ですみませんが、どなたか分かる方いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。 機械はABIで、taqmanプローブを使用しています。 １．絶対定量のstudyで検量線を書いて、複数のサンプル間の遺伝子発現の差をみています。 同サンプル,同目的遺伝子のreal time PCRを複数回かける場合 データの再現性はどのくらい保たれるものなのでしょうか。 上手い人がやると同じ種類のPCRなら何回かけても全く同じ結果になるのでしょうか。 検査の限界がどのくらいか知りたいものでお願いします。 例えば、サンプルAにくらべてサンプルBでは1/2の発現量で、サンプルCでは1/3の発現量だったものが、違う回のPCRでサンプルBは1/3で、サンプルCは1/2 というのは結構あり得るのでしょうか。（1/2、1/3が入れ替わるだけで、B,C両者の発現量の大小が全く変わってしまいます。） それとも、腕の問題でしょうか。 ２．閾値の決定の仕方なのですが、とりあえずautoで問題なさそうなのでautoにしていますが、もしmanualでやる場合、ベースラインが割りと適切に設定されていて、指数関数増幅領域であれば、その範囲内ならどこでもよいのでしょうか。 設定によってquantityにばらつきが出ませんでしょうか？ ３．スタンダードとして選ぶ検体ですが、これは目的遺伝子を一番多く発現しているサンプルを選ぶべきであるとマニュアルには書いてありますが、 調べたい遺伝子が数多くある場合、いちいち全部のサンプルをテストして 一番多く発現しているサンプルを選んでから希釈を作っていくのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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