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精製前には活性がある？ 削除/引用 No.492-10 - 2007/11/19 (月) 10:07:59 - pen 大腸菌による発現だと思いますが、培養直後（Niでの精製前）には十分な活性があるのでしょうか？ 亜鉛結合型のタンパク質では、培養段階で培地中の亜鉛が不足する場合がありますが、この点は大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.492-9 - 2007/11/19 (月) 09:33:50 - ぺぺ IMACでの精製からGSTなんかに変えるのが一番かなと思いますが。 Niカラムじゃなくて、Znカラムで精製すれば？ 違う金属（Ni）が混ざるというリスク？は避けられるのでは Ni-sepharoseをEDTAで洗って、過剰Znを流せばZnカラムに変わるし （溶出方法が・・・という解決法にはなりませんが）

皆さん素早い返信、ありがとうございます 削除/引用 No.492-8 - 2007/11/19 (月) 07:20:25 - ima わかりました。それではさっそく、sample液に亜鉛を添加した上でpHを酸性側にふってみて溶出を試みてみようと思います。 ※SDSは電気泳動で確認したということでした、分かりづらくてすいません。

(無題) 削除/引用 No.492-7 - 2007/11/19 (月) 01:41:43 - おお > しかしながら、元株由来にくらべるとほぼ単一化できているのにも関わらず比活性でいえば10%ほどしかありませんでした。 > > 以上のことから亜鉛イオンが抜けてしまっていることはほぼ確実に思えます。 > SDSを使ってかようかしてカラムに乗せてますか?一瞬そう思いましたがそうでもなさそうですね。 ダメもとで、カラムにつかうバッファーに亜鉛を少量加えて見てはどうでしょうか?デタージェントは使ってますか?デタージェントは物によりけりですが、キレート作用がなくともタンパクの構造を歪めたりもし得ますので、使わないほうが理想的です。変えてみるのも手ですね。 それと、Niを使う直前にreチャージしてなるべくカラムにフリーのキレーターがないようにするとましになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.492-6 - 2007/11/18 (日) 22:44:11 - imac おまけ ５．DTTなど還元剤でも溶出できます。

(無題) 削除/引用 No.492-5 - 2007/11/18 (日) 22:38:53 - imac Ni Sepharose 6 Fast Flowも他のIMACカラムと原理は同じなので、 １．イミダゾールやヒスチジン ２．EDTAやフェナントロリンなど強力キレート剤 ３．酸 ４．Niなどの遷移金属イオン で溶出できるはずです。 ただ、winter8さんが示唆しているとおり、カラム自体がキレート剤の塊なので亜鉛が酵素の表面にあるのであれば失活は不可避かなと思います。

ほぼ単一化できているのに口惜しいです 削除/引用 No.492-4 - 2007/11/18 (日) 21:26:52 - ima 説明が不十分で申し訳ありません pETvectorで発現させてSDSで可溶性に十分な発現を確認し、Niカラムでほぼ単一化できています。 その後、酵素液に亜鉛イオンを加えて4℃で2日ほど優しく撹拌し、金属阻害を考えて透析したところ活性が亜鉛イオン非添加に比べて6倍近くに回復していました。 しかしながら、元株由来にくらべるとほぼ単一化できているのにも関わらず比活性でいえば10%ほどしかありませんでした。 以上のことから亜鉛イオンが抜けてしまっていることはほぼ確実に思えます。 そこで質問なのですがNiカラムにはイミダゾール以外で溶出可能なものがあるのでしょうか。私が現在使用しているNi Sepharose 6 Fast Flowではどうやら無理なようです。

(無題) 削除/引用 No.492-3 - 2007/11/15 (木) 16:55:13 - Winter8 以前、鉄と亜鉛を含むタンパク質を精製したことがあります。 結論から言うと、亜鉛は外れませんでした。 しかし、鉄が外れていたり、透析後もNiカラム由来のNiが入っていたりしたので、Niカラムは良くないと思います。 Niカラムの中の「Niの外れた樹脂」がタンパク質由来の金属を持っていってしまっているのではないかと考えています。（私の場合、鉄ですが） imaさんの亜鉛が外れやすいかどうかはわかりませんが、Niカラムを使うこと自体、避けた方が良いのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.492-2 - 2007/11/15 (木) 09:50:14 - おお 精製する前にそのタンパク特異的な活性をはかれますか?あるいはそのタンパクを発現してない大腸菌に比べてタンパクの量から頷けるぐらいの活性の上昇がありますか? ご指摘の可能性はあるかないかといわれれば低いと思えますがあるとおもいます。 イミダゾールでなく酸性条件下で溶出可能でしょうか?

金属酵素について 削除/引用 No.492-1 - 2007/11/14 (水) 20:33:58 - ima 現在、活性中心に亜鉛イオンが結合している酵素にHis-tagをつけてニッケルカラム（200mMイミダゾールで溶出）で精製しているのですが、精製後に活性測定を行ったところ、一見失活しているように見えました。 イミダゾールが亜鉛イオンと結合するということを知ったのですが、イミダゾールによって亜鉛イオンが取れてしまうことはあるのでしょうか？

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