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ありがとうございます 削除/引用 No.491-8 - 2007/11/14 (水) 21:15:23 - WE APさんのおっしゃることがよくわかりました。 確かにそうですね。ウォーキングしていこうとおもいます。 それとラムダさんにはPCRベースのスクリーニングを紹介してくださり 大変参考になりました。 スクリーニングをやりながらPCRでインサートのチェックは行ってみてはいたのですが 最後までPCR一筋でいけるものなのですね。 もっと楽な方法ないかなと考えているだけで調べたりはしていませんでした。 是非次回は試したいなと思います。 ラムダさん、APさんお二人のお陰で即解決です。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.491-7 - 2007/11/14 (水) 20:03:31 - AP ＞私の周りには今対象としている生物のゲノムサイズが かなり大きいことからそれは考えづらいのではという結論になりました。 補足します。 増幅したライブラリーだと、どのくらいのcoverage・redundancyでprimary libraryを培養したのかによって、complexity（どれだけ多様な種類のクローンを含むか）が違ってきます。ゲノムサイズなどは関係なく、どれだけ多様なクローンを含んだ状態でライブラリーを増幅したかです。 端的に言うと、今回取れた2種類のクローンしか含まれない規模でライブラリーを増幅したとしたら、いくらやってもその2種類しか取れないわけです。 （実際は、先にも書いたような増幅率の違い、サンプリングエラーなどによって、3種類以上入っていても、取れにくいクローンが出てくる可能性はありますが）。

(無題) 削除/引用 No.491-5 - 2007/11/14 (水) 19:28:11 - ラムダ ゲノムサイズが大きいことはこの場合あまり関係ないと思います。むしろ、ライブラリーのサイズ（独立クローン数）に対してどのくらいをスクリーニングしたかの方が大きいのではないでしょうか。 また、1stスクリーニング時のファージ溶液が残っているなら、インサート内に１つベクターに１つプライマー（これは既にあるんですよね）を設定したPCRで、最初に見えていたクローンが最終的に単離できたものと同じかどうかは簡単にチェックできます。 また、最初から全てをハイブリでスクリーニングするのは、沢山のプレートをまかなくてはならないので大変だと思います。古い方のフォーラムに、PCRを使ったsib-selectionでファージのクローニングをする方法についての議論がありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=2215

(無題) 削除/引用 No.491-4 - 2007/11/14 (水) 19:12:41 - AP ＞5個のうち4、1で2種類のものがとれてきていて 私の周りには今対象としている生物のゲノムサイズが かなり大きいことからそれは考えづらいのではという結論になりました。 いったん増幅したライブラリーならありがちなことだと思います。 クローンによって増殖率が異なるので、4:1という頻度の違いが出るのはおかしくないと思います。 ＞さらにその2種類はかなりだぶっていて目的領域としてもう少し欲しいなといった状況です。 そこでスクリーニングをやり直そうと思っているのですが 同じプローブでやり直すよりも、今回取れたクローンの端の配列を使ってwalkingしたほうが建設的だと思います。

はい、そうかもしれないですが・・・ 削除/引用 No.491-3 - 2007/11/14 (水) 18:46:37 - WE 私もそうかなと最初思ったのですが、 5個のうち4、1で2種類のものがとれてきていて 私の周りには今対象としている生物のゲノムサイズが かなり大きいことからそれは考えづらいのではという結論になりました。 でも可能性は完全に否定されたわけでもなく、もしそのような結果であるのならばそれを受け入れるまでなのですが･･･

(無題) 削除/引用 No.491-2 - 2007/11/14 (水) 18:00:08 - ラムダ 作製して播きだしたばかりのものではなくって、増幅したライブラリーですよね。単にライブラリーのサイズが小さくって、同じクローンが複数回取れたということではないでしょうか？

ファージのライブラリーからのスクリーニング時のコンタミ 削除/引用 No.491-1 - 2007/11/14 (水) 17:53:36 - WE λファージからのゲノミックライブラリーからのスクリーニングを行い 5種類のファージクローンを単離することができたと思っておりましたが コンティグを作成するためにインサートをPCR増幅して制限酵素処理を行ったところ そのうち独立なものが2種類しかとれていませんでした。 （同一の消化パターンを示すものが複数ずつあったということです） さらにその2種類はかなりだぶっていて目的領域としてもう少し欲しいなといった状況です。 そこでスクリーニングをやり直そうと思っているのですが どの操作がコンタミを招いたのか思い当る節が殆どありません。 一連のスクリーニング手法は羊土社から出版されているプロトコールを参考にやっています。 あるとすればファージ液を希釈する際などのピペッティングかなと思いますがもしも私と同じような経験をされたことのあるかたがいらっしゃいましたら原因として思い当る点や改善策など当時のことを教えてください。

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