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ありがとうございました！ 削除/引用 No.484-12 - 2007/11/19 (月) 13:28:33 - マックス ＞ちゃまるさん 返信が遅くなりすみませんでした。 ネットで調べてみました。 これからボスに相談してみようと思います。 教えていただき、ありがとうございました。 ＞DCさん TNF-a非添加で血漿成分によって自発的に分化するDCのことは知りませんでした。ここのところをもう少し調べてみようと思います。 HLA-DRの発現は毎回調べていますが、B７の発現に関しては確認していませんでした。いろいろご指摘を頂いたので、どのマーカーを調べたら一番よいのか吟味してみたいと思います。 非常に参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.484-11 - 2007/11/19 (月) 12:38:37 - DC 私も、”マックス”さんと同様の実験を行なった（Auto MACSではなく、手動ですが）事がありますが、みなさんの仰る通り、PBMC由来のCD14 (+) monocyteをGM-CSF + IL-4存在下で培養するとdendritic cell (Monocyte-derived DC: Mo-DC)が分化してきます。このDCがCD14 (-)ですので、そのせいでCD14 (+) monocyteのpopulationが減少しているように見えるだけでしょう。 CD83はDCのmaturationマーカー（古い知識なので、現在もこの目的で使われているかは不明ですが）ですので、”まつ”さんの仰るTNF-a非添加の場合でのCD83 (+) DCは恐らく血漿成分などによって自発的にmatureになったDCだと思います。 Mo-DCへの分化は”まつ”さんの見られたようなCD1aの他にHLA-DRやB7分子なども指標になるかと思います。 当然ご存じかと思いますが、これらのDCをTNF-aやCD40L, TLR-ligandで刺激することでmature DCになりますので、HLA-DRやB7の発現が上昇すると思います。 もし、Mφへの分化を行ないたいとお思いでしたら、G-CSFなどを用いる方がいいのではないでしょうか。GM-CSFを用いるとどうしてもDCが分化してきますし、IL-4の添加がMφの分化を抑制するという話は聞いたことがあります。 ご参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.484-10 - 2007/11/15 (木) 17:54:08 - ちゃまる EZではなくEasysepでした。すいません。 stemcell tecnology？の製品だと思います。 VERITASというメーカーさんを通して購入しています。 ダイナビーズとかもあつかっているところです。 磁気ビースを用いてカラムを通さず精製します。 MACSと手間は同じくらいです。 autoMACSは持ってませんのでどんなものかわかりませんが。

ありがとうございます 削除/引用 No.484-9 - 2007/11/15 (木) 17:00:12 - マックス ＞ちゃまるさん EZsepというものを初めて耳にしたのですが、どこのメーカーから出ているものか教えていただけませんか？ ＞あさん 確かに今回使用したIL-4が少し古いものでした。 新しいIL-4を購入したので、次はそれを用いて同様の実験を行う予定です。 ご指摘ありがとうございました！ ＞momさん 分離後のviabilityはFACSの時のPIで染まらなかった細胞のpupolationで判断していまして、大体80%くらいでした。cell countの際のトリパンブルー非染色細胞数でviabilityを確認することも必要ですよね。次回から行います。 今回はautoMACSのメンテナンスが入ったすぐ後に使い、それ以前にviabilityが問題になったことがなかったので機械の問題ではないと思うのですが、一応問い合わせてみようと思います。 ありがとうございました！ ＞まつさん CD1aの発現率は確認していませんでした。 まつさんから紹介していただいた「免疫研究の基礎技術」を調べてみます。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.484-8 - 2007/11/15 (木) 13:40:51 - まつ すいません、７年くらい前の実験だったので、あいまいに発言してしまいました。実験結果を見直したところ、１週間でmatureにするには、IL-4とGM-CSFの他に途中でTNF-αを加えていました。それでも５０％程度のＣＤ８３陽性率でした。TNF-αを加えない場合は、１５〜２０％ぐらいでしょうか。その際、TNF-αを加える加えないにかかわらず、ＣＤ１４の発現はほとんどなくなり、そのかわりに樹状細胞マーカーであるＣＤ１ａが発現していることを確認しています。ヒト単球の分離は、「免疫研究の基礎技術」（羊土社）の、p68の方法だと簡単に大量にできますよ。特大のフラスコを使って。

分離後のvaiability 削除/引用 No.484-7 - 2007/11/15 (木) 10:35:23 - mom 私はCD14は使ったことがないのでわかりませんが、他の血球系細胞をAutoMACSを使ってpossel_d2で分離したとき（2回カラムをかける）の分離後の細胞のvaiabilityは毎回90％以上でした（トリパンブルー染色して計数）。マックスさんは、分離後のviabilityを確認していますか？ ちゃまるさんの例のように、細胞の種類その他によって違うということかもしれませんが、カラムから押し出す時の圧力が手動よりもAutoの方が改善されている可能性もありますし、事例が増えて対策ができているかもしれません。とにかく一度業者へ問い合わせてみては？（もう問い合わせ済みでしたら失礼。）

(無題) 削除/引用 No.484-6 - 2007/11/14 (水) 21:47:09 - あ 今回の問題は、まつさんのおっしゃるとおり、monocyteがDCに分化してCD14の発現がdownregulateされただけで、viabilityの問題ではないと思います。 また、サイトカインは論文等で示されている濃度で使われていると思いますが、 会社やlotによってtiterが変わってきます。 濃度を振ってみるのが良いんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.484-5 - 2007/11/14 (水) 21:21:55 - ちゃまる EZsepがおすすめです。 MACSと同程度の純度で回収出来、値段も半分くらい。 死細胞もほとんど出ません。 抗体の種類が少ないですが、FITCやPE、biotinが使えます。

ありがとうございました 削除/引用 No.484-4 - 2007/11/14 (水) 16:09:42 - マックス ＞まつさん その時培養したCD14(-)細胞の(isotype controlと比較した)CD83発現率は大体どのくらいでしたか？ 差し支えなければ教えてください。 ちなみに自分のは大体50%くらいだったのですが・・・。 これだとmaturationがかかっているとは言えませんよね？ ＞ちゃまるさん FACS sortingの方が生存率がよかったのですね。 しかもデモを行った結果でも生存率が改善されなかったのですね。 MACSを行う以上カラムから押し出すことは必須ですから、そのダメージは否めないですし・・・。 参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.484-3 - 2007/11/14 (水) 10:13:28 - ちゃまる Auto MACSは持ってないので、手動のMACSの話ですが、やはりカラムを通すと死細胞の割合がかなり高くなります。カラムから押し出すときの圧力で死ぬらしいです。他のメーカーと比較しましたが、やはりMACSのほうが死細胞の割合がかなり高かったです。 そんなはずはないと、MACS の技術者がこられデモをして下さったのですが、やはり死細胞の割合は改善されませんでした。 FACS sortingのほうがダメージは少ないように思います。cellsorterの性能により回収率はまちまちですが。

(無題) 削除/引用 No.484-2 - 2007/11/14 (水) 10:08:23 - まつ 以前、フラスコ接着法でIL-4とGM-CSF添加AIM-V培地(自己血漿入り)でヒト単球を培養していましたが、1週間すると成熟してmatureなdendritic cellになり、CD14は消失してCD83陽性になります。予備実験でautoMAXも使いましたが、同様の結果が出たと思います。

CD14細胞のautoMACS 削除/引用 No.484-1 - 2007/11/13 (火) 21:24:45 - マックス ヒト末梢血単核球を採取して、CD14-FITC micro beadsをつけてMACSをかけ(プロトコールはpossel)、IL-4とGM-CSF添加AIM-V培地(自己血漿入り)で１週間培養すると、CD14 positiveで取れてきた細胞が25-30％くらいまで減ってしまいます。 autoMACSはsortingよりも細胞へのダメージが少なく、細胞が減ることはあっても半分程度であろうというボスの意見なのですが、なぜここまで細胞が減ってしまうのかわかりません。 MACSでとってきた細胞はアポトーシスを起こしやすいというどこかのメーカーのカタログを見たことがあるのですが、これは本当なのでしょうか？ 細胞培養についてド素人なものですみません。 どなたかわかる方がいらっしゃったらぜひ教えてください。 よろしくお願いします。

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