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(無題) 削除/引用 No.481-8 - 2007/11/14 (水) 18:03:23 - nana CBBは使用しているのですが、アクリルアミドはフィルターにかけておりませんでした。サンプルの脂質なども除去して、チャレンジしてみます。 色々教えて頂いてありがとうございます。もしまたお気づきの点がありましたら、是非教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.481-7 - 2007/11/14 (水) 11:42:15 - おお あ、加えてもしゲルを作成している時はポリアクリドアミド溶液をフィルターした方がいいかもしれません(もししてなかったら)。

(無題) 削除/引用 No.481-6 - 2007/11/13 (火) 21:51:22 - おお 低分子の分解能が悪いということですね。理由はいろいろ考えられると思いますが、多分サンプルの濃度とかはもうすでに考慮されているのだと思います。実はいろいろなものがSDSPAGEに影響を与えます。塩濃度は考慮されているようですが、TRICINEを使うSDSPAGEはさほど塩濃度に影響されません。文献によると1MぐらいのNaClでも大丈夫のようです。その他に一般的に影響がありうる物は脂質であるとかDNA、RNAなどです。特に脂質はサンプルの調整の段階で工夫できます。TCAやアセトンを使って１度たんぱく質を沈殿させてからSDSPAGEようバッファーにけんだくし、超音波処理をするといいかもしれません。 あとお気付きと思いますがTRICINEシステムの低分子のバンドはへの字型というか、蒲鉾形のバンドになる傾向があります。それと特に低分子領域と言う事なのでもしご自分で作成されているのでしたらゲルの重合をなるべく完全にした方がいいかもしれませんね。作成後少し時間を置くといいかもしれません。前日に作るぐらいでもいいかもしれませんよ。 それとこれは多分大丈夫と思いますが、サンプルバッファーは従来のSDSPAGEは青い色素BPBをよく使いますが、BPBは先頭を走らず少し遅れてエイどうされます。CBBとかに変えた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.481-5 - 2007/11/13 (火) 19:07:34 - nana 教えていただいたトピック中の論文は参考にしているのですが、なかなか上手くいきません....。

(無題) 削除/引用 No.481-4 - 2007/11/13 (火) 19:03:05 - nana 16.5%のゲルを使用しています。レインボーマーカーなどは、一番下の3.5kDaまできれいに分離できるのですが、組織から抽出したタンパクを流すと、10kDa以下がCBBの青色でスメア状になってしまいます。サンプルバッファーの量を多くして、塩濃度を薄めてみてもあまり変化がなく困っております。

(無題) 削除/引用 No.481-3 - 2007/11/13 (火) 18:21:13 - A 連続投稿すいません。もう見たかもしれませんが以下のトッピックが 参考になるのでは? http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=475

(無題) 削除/引用 No.481-2 - 2007/11/13 (火) 18:18:04 - A 何％のアクリルアミドを使っていますか？

10kDa以下のTricine-SDS 削除/引用 No.481-1 - 2007/11/13 (火) 14:55:01 - nana Tricine-SDS用のサンプルバッファーを用い、超音波を使ってタンパクを抽出した後、Tricineバッファーで泳動しているのですが、10kDa以下のタンパクがスメア状になってうまく流れません。アプライ量をかえたり、濃度をかえてみてもスメアが解消されず、目的の5kDaのバンドが得られません。以前のトピックで、培養細胞からのタンパク抽出で同様のことが質問されていますが、使用しているタンパクはすでに超音波をかけています。 　どなたか、うまく泳動するコツをご存じの方がおられましたら是非教えて頂けないでしょうか。

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