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サザンによる挿入遺伝子のコピー数の決定 トピック削除
No.467-TOPIC - 2007/11/09 (金) 16:14:21 - ドロちゃん
現在、形質転換動物のゲノム中の挿入遺伝子のコピー数を調べるために、genomic Southern blottingを行おうと思っています。

複数の挿入系統のうち、1コピーのみが挿入されている系統だけを単離したいのですが、genomic Southernによってそれは可能でしょうか?
コピー数がどれくらいあるかは、hybridizeさせた時のsignalの強さを目視で確認することで判定するのだと思います(もしかして間違ってますでしょうか?)が、1コピーか2コピー以上かを確実に判定することが出来るのでしょうか?

基本的な質問で大変恐縮ですが、ご回答よろしくお願い致します。
 
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No.467-8 - 2007/11/11 (日) 22:13:20 - AP
>実際そのようなケースがどのくらいの確率で起こるのか知らないので、もしかしたら無視出来るくらいに低頻度でしか起こらないのかも知れませんが…。

新たに遺伝子導入を行ってPを挿入した場合には稀、というかほとんど起こらないと思います。
いったん挿入したPを再転移させた場合、もとあった場所に近いところに入りやすく、しばしばすぐ隣に入ることがあり、挿入が切り出されたあとが姉妹染色体で組換え修復されてもとのコピーが残ることがあります。そういった場合はhead-to-headあるいはhead-to-tailにちかいタンデムになる場合はあります。

もしそういうことがあったとしても、トランスジェニックマウスのように、コンストラクトがhead-to-tailで多数連なって挿入するということはまずないでしょう。そういう形態の挿入の場合は、どんな切り方をしても同じ繰り返し単位の断片が複数生じるか、タンデムリピートをすべて内包する一個の断片にしかできないので、コピー数をサザンのシグナル強度やqPCRで推定するくらいしか手がありません。でもPの場合は仮におきたとしてもせいぜい数個のタンデム、しかも完全なhead-to-tailではなくランダムな長さのスペーサーがあいだに入るはずですから、先に書いた

>なので、たとえばベクター内部で一箇所切れる制限酵素で消化、そのサイトから右側だけ、あるいは左側だけのユニークな配列(inverted repeatなどを含まない)をプローブにして、インサートの片側+隣り合ったゲノムのフラグメントを検出するといいでしょう。

で、問題は回避できます。

ただし、異なる挿入を検出するバンドが偶然ほぼ同じ長さを生じる場合もありますから、複数の切り方をして見ることをお勧めします。

蛇足ですが、P由来の配列をプローブにすると、ゲノム中に潜在的に存在しているPの痕跡(一般的なラボ系統はP-freeということになっていますが、実際はそうでもないようです)を拾ってしまう可能性があるので、exogenousは配列をプローブにするのが理想的です。

(無題) 削除/引用
No.467-7 - 2007/11/11 (日) 22:04:42 - う〜んと
>ところで、1つ気になったのですが、

認識配列の違う複数の制限酵素で切断して、バンドの数が同じになれば信頼性は高まるでしょね。

でも最近はこういう場合って定量リアルタイムPCRの出番じゃないんでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.467-6 - 2007/11/11 (日) 18:45:51 - ドロちゃん
> Rik様
ご回答ありがとうございます。
なるほど、やはりシグナル強度からは挿入が1コピーか否かは正確には判らないのですね。
参考になりました。

> AP様
ご回答ありがとうございます。
バンドの数からコピー数が判定出来るのですね。
つまり、検出されたバンドが1本だけならコピー数は1つ、と。
確かにそれなら信憑性が高そうです。

ところで、1つ気になったのですが、ゲノム上の1ヶ所というか非常に近いサイトにタンデムに複数の挿入が起こって、それらの挿入点の間に制限酵素サイトが存在しないような場合、複数コピーの挿入があるのにバンドが1本だけしか検出されない、という結果になるかと思うのですが、その可能性を排除したい場合はやはり他の方法での確認が必要なのでしょうか?
実際そのようなケースがどのくらいの確率で起こるのか知らないので、もしかしたら無視出来るくらいに低頻度でしか起こらないのかも知れませんが…。

大変お手数お掛けしますが、ご回答いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用
No.467-5 - 2007/11/09 (金) 17:55:16 - AP
HNからそうではないかとおもいましたが、、、、

その場合はバンドの数で調べられます。

単純には、ベクター内部を全く切らない制限酵素でゲノムDNAを消化して、ベクター配列のプローブで検出します。挿入ベクター周辺でその制限酵素サイトが現れる位置というのは、どこに入ったかによって異なるので、挿入位置ごと異なるフラグメント長を示します。

ただし、ベクターを全く切らない酵素でこれをやろうとすると、フラグメント長が長くなりすぎで分解能が落ちます。

なので、たとえばベクター内部で一箇所切れる制限酵素で消化、そのサイトから右側だけ、あるいは左側だけのユニークな配列(inverted repeatなどを含まない)をプローブにして、インサートの片側+隣り合ったゲノムのフラグメントを検出するといいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.467-4 - 2007/11/09 (金) 17:53:40 - Rik
随分昔ですが或るマウス遺伝子のコピー数をサザンで確認しようとしました。
当該遺伝子を組み込んだベクターを段階希釈したものとシグナル強度を比較したりして、出来る限りきっちり頑張ったつもりですが、結果としては「ゲノム中に5個も10個もコピ−が存在する訳ではない」という結論しか出せませんでした。すなわち、1コピーか2コピーか、というレベルまではサザンのシグナル強度からは判断出来なかったのです。自分としては、1個と言っても良いのではないかな、という感じのデータは出せたのですが、ラボミーティングでは散々に叩かれました。生物種が違うので勝手も違うのかもしれませんが、サザンだけで判断するのではなく、さらに別の角度からも検証するなりして確認されるのが良いかと思います。頑張って下さい。

(無題) 削除/引用
No.467-3 - 2007/11/09 (金) 17:37:16 - ドロちゃん
> AP様
大変失礼致しました。
動物はキイロショウジョウバエで、P因子トランスポゾンのベクター(pPTGALベクター)を胚に微量注入(phsπヘルパープラスミドを使用)することにより形質転換体を得ました。

初心者なものでお手数をお掛けしますが、他に必要な情報はありますでしょうか?
よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.467-2 - 2007/11/09 (金) 17:25:55 - AP
材料生物と導入方法(ベクターその他)の情報が必要です。

つまり、複数挿入するにしても一コピーずつ独立して入るのか(トランスポゾンベクターなど)、タンデムに重複したものがはいるのか(一般的なマウスのトランスジェニックなど)によって方法論が異なります。

サザンによる挿入遺伝子のコピー数の決定 削除/引用
No.467-1 - 2007/11/09 (金) 16:14:21 - ドロちゃん
現在、形質転換動物のゲノム中の挿入遺伝子のコピー数を調べるために、genomic Southern blottingを行おうと思っています。

複数の挿入系統のうち、1コピーのみが挿入されている系統だけを単離したいのですが、genomic Southernによってそれは可能でしょうか?
コピー数がどれくらいあるかは、hybridizeさせた時のsignalの強さを目視で確認することで判定するのだと思います(もしかして間違ってますでしょうか?)が、1コピーか2コピー以上かを確実に判定することが出来るのでしょうか?

基本的な質問で大変恐縮ですが、ご回答よろしくお願い致します。

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