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(無題) 削除/引用 No.458-11 - 2007/11/13 (火) 10:01:47 - K おお様 アドバイスありがとうございます。 本当のところを申し上げると、現在就活中でして、 集中して実験ができない状態です。 考える時間はありますので、いろいろな条件をよく検討して、 就活が終わり次第、実験に取りかかろうと思います。 みなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.458-10 - 2007/11/12 (月) 23:25:24 - おお NP-40,triton-x100はUV領域とくに280近くに鋭いピークがありますので、１度カラムなしでモニターにバッファーを通して様子を見た方がよさそうです。 washは5CVs以上であればたいていいいですね。特に最初の1-2CVあたりはタンパクがいっぺんに落ちてくるところなので少しフラクションをわけて置けば、余分なものが落ちてるかとか、あなたの必要なタンパクが落ちてないかと確認しやすいと思います。

(無題) 削除/引用 No.458-9 - 2007/11/12 (月) 15:56:23 - K おお様、ありがとうございます。 >あとカオトロピック作用のない塩を1Mぐらいにするとデタージェントがこんどは解けなくなることがあります。MgやLiは大丈夫だろうなとおもいますが、、、 なるほど…今の、ウォッシュバッファーには 1 M NaCl が含まれていますので、 もしかすると、デタージェントが溶けない場合もあるかもしれません その場合は、TBSでカラムを洗って、その上で、デタージェント入りのバッファーで洗えばいいと考えます。 スキームとしては、 1. ウォッシュバッファーに溶解したPEG沈殿物を抗体カラムに負荷 2. A280をモニターしながらウォッシュバッファーで洗浄。 3. TBSで洗浄。5 column vol.ぐらい？ 4. Mg or デタージェント(NP-40, Triton-X100, Tween-20)入りのTBSで洗浄。 5. TBSで洗浄。10 column vol.ぐらい？ 6. Gly-HCl でelute. と考えています。 なにか足りないとか、こうした方がいい、ということがあれば、 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.458-8 - 2007/11/09 (金) 11:45:25 - おお > 目的のタンパク質は血清タンパク質ですので、Twennは使えると考えますが、いかがでしょうか？ 実際に避ける人が多いですが、そんなに気にしなくていいかなとも思います。 > > >特にデオキシコール酸、CHAPS/CHAPSOは抗体によっては相性がわるいこともあるようです。 > 抗体はウサギのポリクロで、使用量に限界がありまして… > そうですね…デオキシコール酸、CHAPSは避けた方が良い様に思いますね。 そうかもしれません。デタージェント選びは運だともいえます。そのほかにもいろいろデタージェントはありますが、幅が広くなりすぎてその割にはどれも一緒とかつかえないとか言うのも可能せいとしてありますね。 デタージェントのついてもっと細かくいうとするならたいてい電荷を持たないものが弱いと言われています。 今まで挙げた以外だとオクチルグロコシドとか糖骨格に疎水的な炭素鎖がついたものなどがあります。特徴としては、たいていの電荷を持たないものが大きなミセルを作るのに対して、これらは見せるサイズが小さいことです。 MEGA-9/10というのもありますが、抗体との相性は分かりません。 選択の方法としては、それぞれのデタージェント存在下でウエスタンするとIPより消費が抑えられると思います。 > 洗浄バッファーに終濃度が1MになるようにMgを加えればいいのでしょうか？ > 確か、高濃度のMgの溶液は粘稠になると聞いた事があって、 > 流速が落ちるのは、嫌だなぁ、と(低温室で精製するので) Mgはちょっとくせ者で、アルカリ側で沈殿してきますので少し酸性がわに振らないといけないかもしれません。実は3.5Mくらいで抗体からたんぱく質をはがすのにたまに使います。ですから高すぎるとどうかなと、、、いうわけで1Mぐらいと思ってたのですが、、、3.5Mでねんちょうのように感じますが、1Mでカラムというのは実際は私もよく分かりません。 あとカオトロピック作用のない塩を1Mぐらいにするとデタージェントがこんどは解けなくなることがあります。MgやLiは大丈夫だろうなとおもいますが、、、

(無題) 削除/引用 No.458-7 - 2007/11/09 (金) 10:21:27 - K おお 様 >tweenなどもマイルドですが、ソルビトール骨格が酵素的に分解される可能せいがあるので、細胞溶解などに使うことはまれです。 これは初めて知りました。Twennも分解されるのですね。 目的のタンパク質は血清タンパク質ですので、Twennは使えると考えますが、いかがでしょうか？ >特にデオキシコール酸、CHAPS/CHAPSOは抗体によっては相性がわるいこともあるようです。 抗体はウサギのポリクロで、使用量に限界がありまして… そうですね…デオキシコール酸、CHAPSは避けた方が良い様に思いますね。 >LiClやMgイオンが使えると思います。弱いカオトロピック作用があります。LiClは500-1000mMぐらい、Mgも1Mぐらいでしょうか。 Mgは聞いた事があります。 洗浄バッファーに終濃度が1MになるようにMgを加えればいいのでしょうか？ 確か、高濃度のMgの溶液は粘稠になると聞いた事があって、 流速が落ちるのは、嫌だなぁ、と(低温室で精製するので) >あとはいきなり抗体を使わず、ゲル濾過とかクロマトで目的のタンパクの来るフラクションを集めて、抗体で回収するのもてかと思います。そうするとコンプレックスについて多次元で情報が得られますし。 一番上で申し上げた通り、モノは血清中に含まれています。 ですので、まず、PEG沈で簡単に分画して、それを抗体カラムにかけています。 もちろんPEG沈の当たりフラクションはwesternで確認しています。 PEG沈してイオン交換にかけて、当たりを抗体カラムにかけてみるのも手だとは考えています。

(無題) 削除/引用 No.458-6 - 2007/11/09 (金) 10:11:32 - K みなさま、アドバイスありがとうございます。 長文にご容赦いただいて、レスをつけたいと思います。 washer 様 >非特異的な結合は極力除ける程度には強力で、問題の複合体は解離させない程度には穏和な条件ということになりますが、この理解で正しいでしょうか？ その通りです。 >グリセロールは複合体の安定化には有効だと思いますが、洗浄力を上げる効果は期待できないのではないでしょうか。 Ni-NTAカラムでタンパク質を精製した時に、 洗浄バッファーにグリセロールを使うと、非特異的結合が減って、タンパク質が精製されたのを思い出して、 グリセロールはどうかと考えたのですが… >これはカラムを洗浄後、何らかの方法で結合しているタンパク質を溶出したということだと思いますが、それにはどういう方法を用いられたのでしょうか？ 洗浄後、0.1 M Gly-HCl, pH 2.5 を用いて溶出し、溶出物はTrisで中和しました。 これをサンプルとして、SDS-PAGEにかけたわけです。 a 様 >抗体カラムを使用しての蛋白質複合体の同定ということでよろしいでしょうか？ その通りです。 >樹脂にもよりますが非特異的な結合は必ずあると思います。もし可能なら、コントロールの抗体カラムも作製し、特異的に結合しているか比較した方が良いと思います。 なるほど… コントロールをとることはできるので、やってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.458-5 - 2007/11/09 (金) 06:17:55 - おお デタージェントでよく使うのはNP-40、Triton-x100でしょうか。tweenなどもマイルドですが、ソルビトール骨格が酵素的に分解される可能せいがあるので、細胞溶解などに使うことはまれです。そのほかデオキシコール酸、CHAPS/CHAPSOといったスレロイド様骨格のものもたまに使われます。しかしデタージェントを使う方法は場合によってはタンパク相互作用を切ってしまいます。例えばデオキシコール酸はCDK-Cyclinのコンプレックスは壊しませんが、CDK-Cyclinに含まれるCDK inhibitorを外します。特にデオキシコール酸、CHAPS/CHAPSOは抗体によっては相性がわるいこともあるようです。 デタージェント以外ではLiClやMgイオンが使えると思います。弱いカオトロピック作用があります。LiClは500-1000mMぐらい Mgも1Mぐらいでしょうか。 あとはいきなり抗体を使わず、ゲル濾過とかクロマトで目的のタンパクの来るフラクションを集めて、抗体で回収するのもてかと思います。そうするとコンプレックスについて多次元で情報が得られますし。

(無題) 削除/引用 No.458-4 - 2007/11/08 (木) 20:19:31 - a 抗体カラムを使用しての蛋白質複合体の同定ということでよろしいでしょうか？ 樹脂にもよりますが非特異的な結合は必ずあると思います。もし可能なら、コントロールの抗体カラムも作製し、特異的に結合しているか比較した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.458-3 - 2007/11/08 (木) 16:19:07 - washer 目的はその複合体を複合体として精製することですよね。だとすると、非特異的な結合は極力除ける程度には強力で、問題の複合体は解離させない程度には穏和な条件ということになりますが、この理解で正しいでしょうか？だとすると、その複合体の性格に依りけりで、なかなか難しいところですね。仰るように、いろいろな界面活性剤を検討する、塩濃度と塩の種類を検討する（LiClなど）くらいでしょうか。グリセロールは複合体の安定化には有効だと思いますが、洗浄力を上げる効果は期待できないのではないでしょうか。 また、「だいぶ溶出物が与えるバンドがきれいになった」とあるのですが、これはカラムを洗浄後、何らかの方法で結合しているタンパク質を溶出したということだと思いますが、それにはどういう方法を用いられたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.458-2 - 2007/11/08 (木) 14:49:31 - ats 界面活性剤に関しては、マイルドな膜タンパクの可溶化剤が参考になるかも。 http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/DS04?OpenDocument

バッファーの最適化 削除/引用 No.458-1 - 2007/11/07 (水) 13:18:15 - K いつもお世話になっています。 あるタンパク質複合体を単離する研究をしています。 この複合体のあるサブユニットだけは遺伝子が判明していますので、 それをもとに組換えタンパク質を精製し、これを抗原として抗体を調製しました。 この抗体を使って、western blotしたところ、予想分子量にほぼ合致するバンドを得ることができました。 続いて、抗体を固相化して、いよいよ単離という段階に達しています。 そこで、カラムを洗浄するバッファーなのですが、 1 M NaClを含むtris bufferを用いています。 これでだいぶ溶出物が与えるバンドがきれいになったのですが、まだ不純物があるようです。 (そもそも不純物かどうかもわかりませんが) 1 M NaClというのはだいぶ過酷な条件かと思われますが、 この他に加えるとすれば何にすべきでしょうか？ もちろん、やってみなければわからないのはわかっていますが。 非イオン系の界面活性剤(Tween-20? Triton X?) グリセロール ぐらいでしょうか 強力な変性剤や還元剤は避けたいと考えています。 何を加えるにせよ、問題は終濃度ですね。 一般的なケースというのがないようにも思われますが、 みなさんの経験から教えて頂ければ、と思います。 よろしくお願いします。

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