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(無題) 削除/引用 No.444-5 - 2007/11/05 (月) 01:00:32 - おお You might want to refer the following topc. http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=407 As it is already suggested, After purification of RNA, you might have something inhibiting DNase activity. It could be phenol, SDS and Ethanol. They can be elimiate by CIAA treatment and ethanol precipitation. In the case of ethanol, make sure that ethanol is gone after ethanol, after precipitation.

(無題) 削除/引用 No.444-3 - 2007/11/03 (土) 17:21:04 - あれい フェノール-SDS法後はRNAを水で溶かしていますか？ DNaseのUnitにあわせた許容範囲のRNA量で反応させていますか？ DNAのコンタミは何で検出していますか？PCR? 私が以前やっていたのはProm○gaのDNaseを用い UnitにあわせたRNA量で37℃30min。 その後はEDTAを含む熱変性　or　フェノクロを行う。 ポジコン（genome）,採取したRNA,ネガコン（水）でPCR。 採取したRNAでバンドが出なければ成功としました。 もしかすると、もこさんの扱っている細菌のgenomeDNAで濃度を振ってDNaseの効きを確認されたほうがいいかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.444-2 - 2007/11/03 (土) 17:05:23 - ats >[Re:1] もこさんは書きました : > 酵素反応時にはRNAとDNaseI、そこにbufferを入れて... 通常、酵素は一番最後に加えないと失活しますよ。 DNaseIは、Mgを要求しますがbufferには含まれていますか。 阻害物質に関して（あなたが採用した方法は液量など細かい手法まで世界共通とは限らないので）RNA抽出法を詳しく教えていただかないとお答えようがないです。 考えられるのは、フェノ−ルの残留がよくある失敗です。SDSも注意しないと沈殿します。 フェノ−ルの残留なら、クロロホルム抽出を２回以上行って、EtOH沈殿後、80%EtOHリンスを行えば取り除けます。極く少量なら、EtOH沈殿後、80%EtOHリンスを繰り返せば除けます。SDSも通常なら上記方法で取り除けます。

total RNA抽出時のDNase処理ができない 削除/引用 No.444-1 - 2007/11/03 (土) 16:21:57 - もこ 細菌からtotal RNAをフェノール-SDS法で抽出しているのですが、 この細菌がプラスミドを持っているためDNaseIで処理しています。 ですが、なぜか酵素が全く効かず困っています。 酵素反応時にはRNAとDNaseI、そこにbufferを入れて 37度、15分で反応させた後、フェノール、CIAで処理しています。 total RNAを取る際にDNaseを阻害する物質が残ることが原因だと 考えているのですが、 何分初心者なものでどの過程に原因があるのかがわかりません。 ほとんどの方がRNA抽出にはキットを使っていらっしゃると思いますが、 どなたかご存知の方ご教授いただけないでしょうか。

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