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論文を読みました。 削除/引用 No.44-4 - 2007/08/09 (木) 00:35:49 - kawa PCRさま。論文を読んでみました。 やはりPCRのovercycleは百害あって一利なしみたいな感じですね。また最初からPCRのやり直しかあ、しかも今度は２サイクル毎に採取して・・・と思っていましたが、この論文にちゃんと解決法まで載っていますねえ。すばらしい。re-conditional PCR、なるほど鋳型を10倍に薄めて３回PCRまわすだけでいいんですね。これなら簡単です。早速明日にでもやってみます。 PCRさま、本当にありがとうございました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.44-3 - 2007/08/08 (水) 16:25:09 - kawa PCRさま。早速のレスありがとうございます。論文をダウンロードし、今日読んでみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.44-2 - 2007/08/08 (水) 15:02:04 - PCR kawaさんのお考えのとおりの機構で生じたものだと思います。次の論文が参考になるのではないでしょうか。 Thompson JR, Marcelino LA, Polz MF. Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by 'reconditioning PCR'. Nucleic Acids Res. 2002 May 1;30(9):2083-8. PMID: 11972349

compound heterozygous mutations 削除/引用 No.44-1 - 2007/08/08 (水) 13:33:23 - kawa ある劣勢遺伝疾患の患者の変異解析を行ったのですが、ホモの変異は見つからず、２カ所にヘテロの変異が見つかりました。両方ともにnon-sense mutationであったので、compound heterozygous mutationsを疑いゲノムをPCRしてからTAクローニングし解析しました。全てのクローンで変異はどちらか片方になるのを予想しており、おおよそその結果となったのですが、不思議なことに１６個中３個のクローンで両方で変異が見つかりました。シーケンスの波形も確認し、特にバックグラウンドが高いための偽陽性というわけでもないようでした。 一応自分なりに結果を解釈しますと、恐らくgenotypeはcompound heterozygous mutationsなのだと思われるが、PCRでovercycleとなったために、mismatched duplexのPCR産物がたくさん出来てしまった。これをベクターに挿入し、大腸菌に入れたため（JM-109です）、mismatch修復系によって修復され、予想されないクローンが生まれてしまった。のではないかと推察しております。 どなたか詳しい方にご教授頂ければ幸いでございます。

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