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(無題) 削除/引用 No.437-10 - 2008/09/21 (日) 05:36:12 - おお >[Re:9] 不可解なエラーさんは書きました : > 私も似たような経験があります。 > Pfuを用いて、普通のPCRクローニングを行ったのですが、何度やってもプライマー内部に変異の生じたクローンしか取れませんでした。 > High Firedityの酵素に何か特異的な作用があるのでしょうか。。。 下のトピが参考になりませんか。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1952

同じ経験が 削除/引用 No.437-9 - 2008/09/21 (日) 05:22:47 - 不可解なエラー 私も似たような経験があります。 Pfuを用いて、普通のPCRクローニングを行ったのですが、何度やってもプライマー内部に変異の生じたクローンしか取れませんでした。 プライマーの合成ミスかと思い、プライマーを2回作り直し、さらに3回目の作り直しにはPAGE精製もかけてもらったのですが、いずれの場合も改善しませんでした。 実は、普通のtaq（タカラのEx-Taq）を用いてPCRクローニングすると、いずれのプライマー（初期のもの、作り直したもの）でもその変異は生じていませんでした。 High Firedityの酵素に何か特異的な作用があるのでしょうか。。。

ちなみに 削除/引用 No.437-8 - 2007/11/13 (火) 02:02:52 - 一太郎 皆さんありがとうございました。解決いたしました

(無題) 削除/引用 No.437-7 - 2007/11/13 (火) 01:55:49 - 一太郎 「おお」さん、コメントありがとうございます！とても参考になりました！

(無題) 削除/引用 No.437-6 - 2007/11/07 (水) 00:36:15 - おお > > ちなみにオリゴのグレードは脱塩でした。長いオリゴは脱塩ではダメですかね。。。 > ちなみに40ぐらいから、HPLCにした方がいいとある会社はホームページに書いています。それと、増えればいいのか、増えたあとの配列が重要かどうかで選択が分かれます。HPLCグレイド35マーぐらいでも、配列によってはPAGEのエイどうパターンがシングルバンドでない場合があります。 そう言う事で、少なくともHPLC、できればPAGE精製を使うのがいいと思います。 例えばアレーのオリゴマーの場合でも、20マーを超えるところぐらいから、エラーを含むオリゴの割合が急激に増えてきます。そういう訳で、従来の合成法よりかなり気を使っていると思います。各ステップで塩基が付加される割合を九十何%として(九十何)^nという計算をしていけば想像がつくと思います。

(無題) 削除/引用 No.437-5 - 2007/11/06 (火) 23:53:43 - 一太郎 サイトダイレクトでDeletion部分を修正することにします。 ちなみにオリゴのグレードは脱塩でした。長いオリゴは脱塩ではダメですかね。。。 皆さんご返信ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.437-4 - 2007/11/02 (金) 10:13:32 - AP ＞ただデリーションが入っているけど手元にプラスミドがあるのですから、そこから始めた方がいいかもしれません。 もうひとつの方法は、 deletionの起こっているサイトを5'側からa, bとして、 5'末端のプライマーとa-b間の配列のプライマーでaが正常なクローンをPCR。 3'末端のプライマーとa-b間の配列のプライマーでbが正常なクローンをPCR。 ただし、両者の産物がa-b間でオーバーラップするようにプライマーを設計。 これらの産物を精製して混ぜて、5'末端のプライマーと3'末端のプライマーでPCRすると、産物として全体の配列ができる。 あるいは、a-b間が十数塩基と短いので、この区間を含み十分な長さをもつ正しい配列のプライマーを両方向作り、いずれかのクローンを鋳型にして、上記のような手順で正しい配列を得ることも出来ると思います。

(無題) 削除/引用 No.437-3 - 2007/11/02 (金) 07:03:13 - おお 難しいですね。オリゴのグレイドはHPLC精製ですか?PAGE精製ですか?基本的に長いのでPAGE精製の方が良いかと思いますが、、、もし精製後のマスのデーターとかあるんだったら見ておく必要がありますね。 HPLC精製だと自分でPAGE精製すると言うのもありですが、、、、、、 ただデリーションが入っているけど手元にプラスミドがあるのですから、そこから始めた方がいいかもしれません。2種類の物があるようですが、断片を切り出して、制限酵素(4ベースカッター)とかで切って正常の部分だけをつなぎ合わせられませんか? それかサイトダイレクトとかででリーション部分を修正するのがベターだと思いますよ(ytさんもそのへんを指摘しておられますね)。 そう言えばタカラが非常にながいDNA(1kbぐらいまで)合成できるようになったという話をしてました。タカラに話だけでも聞いてみてるのもてかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.437-2 - 2007/11/02 (金) 00:44:02 - yt So far I have no idea what caused the deletion. But, if you don't have to identify the mechanism for the deletion, you can get the DNA fragment that you want by making a insertion by site-directed mutagenesis. Then, you do not have to waste your money for very long oligo DNA primers any more.

なぜDeletion？ 削除/引用 No.437-1 - 2007/11/02 (金) 00:22:33 - 一太郎 6本のオリゴプライマー（８０bp)を交互に重なるようにPCRして、220bpほどのPCR断片を作成しました。 この断片をベクターにライゲートさせてシーケンスを読んだところ、おかしなことに１塩基Deletionしていました。8つ読んだプラスミドのうち7つはこのDeletionが含まれています。残りの1つはこのDeletionが起こってないのですが、残念ながら数十塩基先にまた1つ違うDeletion が起こっています。 結局三回ほどPCR,制限酵素処理、ライゲーションを繰り返しましたが、同じ場所にDeletionが起きて、同じようにDeletionが起こっていないプラスミドに限って、数十塩基先に違うDeletionが起きてしまいます。 使用した酵素：KODPlus、またはPfu 制限酵素：NdeI,BamHI このような経験がある方はいますか？ しょうがないので、業者が純度の悪いプライマーを作ったのかな、としか考えられずまた同じプライマーを注文するのですが、同じ結果が起きてしまうと悲しいです。 もしかして、プライマー配列が大腸菌にとってよくない配列なのでしょうか？しかし、Entelechonで配列をbacktranlationして作成してあります。 どう思われますか？

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