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血清の影響 削除/引用 No.432-10 - 2007/11/12 (月) 17:55:39 - aki 血清の影響は大きい（こともある）と思います。 「希釈直線性」は、系によっては（抗体によっては）決まった希釈範囲でしか得られないものと思います。たとえば抗原抗体反応が血清成分で阻害されるケースもあると思います。その逆もありえるはずです。 運良くある希釈レンジで感度・特異度十分のものが製品として出てきているわけですので、希釈濃度は推奨範囲を守らなかった場合には測定値の信頼性に注意が必要です。 個人的には無刺激で感度以下になってしまうような製品の質には大いに不満ですが。

(無題) 削除/引用 No.432-9 - 2007/11/08 (木) 14:35:34 - あう 関連した質問なのですが、 プロトコールに検体、標準バッファーを各wellに例えば10ulづつアプライしなさいと書かれているようなキットで、30や50ulづつアプライしてもよいものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.432-8 - 2007/11/04 (日) 12:55:37 - えらいざ ありがとうございます。 刺激は一般的なアレルギーモデル作成の手順で行い、他の指標でアレルギーになっていることは確認できてます。免疫染色での標的サイトカインの局所の増加も確認できています。 マウス血清ELISAでのサイトカイン測定はやはり難しいというのが一般的なのでしょうか？そうであればELISAにこだわって値を出しても、研究の信憑性自体が問われるような気がします。

ELISAの不備を疑う前に．．． 削除/引用 No.432-7 - 2007/11/04 (日) 08:50:09 - ぽすど君 IL-4, IL-5, IFNgの測定を考えているようですので，サイトカインのソースとしてはT細胞やNKT細胞を想定しているのだと思います． これらの細胞由来と考えると，恐らく質問者さんはマウス生体になんらかの刺激を加えた場合の血清を採取しているのだと思います．過去のPaperを参考にしているところから，質問者さんのオリジナルではなく，一般に用いられる刺激（免疫や感染，あるいは活性化試薬の投与など）をなさっているのだと推察します． 無刺激での血清サイトカイン量は他の方が書かれているとおり非常に低いので，検出は容易ではありません．しかし，適切な刺激を与えた場合には，血清中のサイトカインの検出は十分可能ですので，個人的には刺激が適切か否かをまず確認すべきかと思います． 刺激が適切であったか否かの指標はなにか得られていますか？

(無題) 削除/引用 No.432-6 - 2007/11/03 (土) 23:23:57 - himawari これはあくまで私の経験に基づくものですが、Normalのddyマウスを例にすると血清中のINF-γとかは30pg/ml以下だと思うので、市販されているたいていのELISAキットでは吸光度は0.050以下かそれぐらいの検出感度だと思います。 ENDOGENのINF-γを調べてみました。 http://search.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/EM1001.pdf これを見てみると、NormalのBalb/cで33pg/ml(N=10)らしいです。 ですから、吸光度が低いというのは信頼できると思います。 逆にこれらのキットで血清中のサイトカインのレベルが非常に高いというのはサイトカインストリーム等が起こっている病的な状態であるかもしれませんね。 ということで、よほどの刺激がない限り、血清で検出するのは難しいと思います。 (RIAは間違いなくディテクトできるでしょう） 細胞を分離してConAやLPSで刺激しても放出するサイトカインが1〜5pg/hぐらいが精々だと思いますが、一度トライしてみる価値はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.432-5 - 2007/11/03 (土) 10:12:59 - えらいざ みなさんありがとうございます。 特にhimawariさんの意見は私も以前からほんとうにマウスの微量な血清からサイトカインの測定は可能なのかどうか気になってました。 論文ではマウスの血清サイトカインのELISAのデーターはたくさんあり、うまく検出できないのは自分の手技の問題だと考えてましたが、何回か試してみてもODが低く、希釈倍率によりデーターが大きく左右されておりました。（検量曲線はある程度正確に作成できてました） やはりマウスの血清ではELISAは難しいのでしょうか？ ENDOGENのIL-4,5、INF-γなどを購入して再度検討しようかと思ってましたが、そうであればフローサイトメトリーやまたは組織のホモジネートを使って測定したほうがよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.432-4 - 2007/11/02 (金) 13:22:46 - たいそん サンプルの希釈は、検量線の上限と下限の間にサンプルのOD値が来るように行うものだと認識しています。なので、原液でもシグナルが低い場合には、さらに希釈することを検討するのはどうなのか。。と思います。血清の量が気になるならば、同じサンプルをkitの希釈Bufferと、たとえばラット血清などを用いて希釈して、どの程度差があるのか一度調べればいいと思います。また、検量線のODと濃度の相関係数が非常に高い場合でも（希釈系列を作るのが下手ではないという意味）、同じサンプルを違う希釈倍率で試してみると、理論的には同じにならないとおかしいのですが、必ずしも同じ値にはなってくれません。えらいざさんの言うとおり、高い倍率のものほど誤差が大きくなります。特に、検量線がLinearでfitしない場合には、その傾向が強くでると思います。 サイトカインや自己抗体などのELISAをかなりやりましたが、よく説明書には溶血した場合に反応が阻害されることがあるような記載をみますが、あまり大きく左右された記憶はありません。 サイトカインなどでは高感度のELISAキットもあるので、それを試したらどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.432-3 - 2007/11/01 (木) 23:30:33 - himawari 使用しているメーカーとキットを教えてもらえれば皆様が詳しくお答えして頂けると思います。 とりあえず、メーカー推奨の希釈倍率でやってみてはいかがでしょうか。 私はマウスサイトカインのELISAをほぼ一通りやりましたが、よほどの刺激がない限り、血清からの検出はできないと思います。 （最近、研究費として1ヵ月間で100万以上使いました） マウスサイトカインELISAの場合、splenocyteを調製してConA or LPS刺激後24〜48時間培養して、その培養上清をELISAのサンプルにしています。 この時のサンプルは希釈していません。 血清8-OHdGのELISAも希釈していません。ただし、8-OHdGの場合、血清をそのまま使うと測定結果に影響をもたらすので、限外濾過をしています。 （メーカー推奨です）

プロトコールに従ったほうが。。。 削除/引用 No.432-2 - 2007/11/01 (木) 12:58:41 - プリリン マウスの血清を用いて、ELISAをしていましたが、 メーカーのプロトコルに従って希釈していました。 測定するものによって、2倍希釈のものもあれば、 10,000倍希釈したものもあります。 検量線はきちんと描けました。 メーカーのプロトコルに反して、適切でない値が測定されるより、 指示通りに希釈するべきだと思います。

ELISA検体の希釈による影響 削除/引用 No.432-1 - 2007/11/01 (木) 10:52:06 - えらいざ マウス血清を用いてELISAを行っています。 ほとんど素人なので検体の希釈による知識がなく、最初は希釈なし、あるいは5倍希釈くらいで検体を希釈して行ってましたが予測される値よりかなり低く結果が出ました。 （血清の抽出過程などでは問題ないと思われ、過去の論文から大体の予想測定値もわかっています）。 メーカーにきいてみると25倍以上の希釈が望ましく、それ以下では血清の影響が出るとのことでした。 素人考えでは希釈が大きくなればなるほど後のデーター解析時に誤差が出やすいと考えていたのですが、50倍希釈位にして行うのが一般的なのでしょうか？ たとえばインスリンなどの物質やサイトカインなどの測定するものによっても異なるのでしょうか。 おはずかしい質問で申し訳ありませんがなにぶん素人なもので教えていただきたいです。

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