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(無題) 削除/引用 No.425-5 - 2007/11/02 (金) 19:18:39 - そば 他の方も指摘しているように、そのプロトコールには問題があるように思います。そのプロトコール通りに実験を行うのは避けて、他のプロトコールを参考にしてはいかがでしょうか？ マウス培養細胞アストロサイトを用いたもの http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/13750002.pdf 哺乳動物細胞へのトランスフェクション http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/11668102.pdf ちなみに私がLipofectamine2000を使用する場合、プラスミドのトランスフェクションプロトコールと全く同じプロトコールでsiRNAを細胞に導入しています（siRNAの量が少なくてもLipofectamin2000の量は変更していません。細胞用培地中には血清、抗生剤有り）。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.425-4 - 2007/10/31 (水) 10:06:44 - りょう 通りすがりさんもお気づきのようですが・・・、 このプロトコールは誤解を招くような記載不備があります。 6well plateに100マイクロリットルのmediumで維持するのはおかしいです（例えsiRNA/lipofectamine2000 complexを作用させる時だけにしても） この100マイクロリットルというのは単にcomplexを作成させるときにボリュームであり、細胞の方はあらかじめ1-2mlのmedium(例えばOPTI-MEMや抗生物質抜き・血清抜きのDMEM）で用意されているはずです。 siRNA添加に関わらず、lipofectamineやlipofectamine2000の一般的使用法は、そうなっているはずです。 よって細胞は2mlくらいのmedium中で20pmolのsiRNAが作用しており10nMになるはずです。

(無題) 削除/引用 No.425-3 - 2007/10/31 (水) 07:48:45 - 通りすがり いや、trasnfectionして最初の取り込まれるはずの 16時間での培地の量で計算するはずで 20pmol/100uLなので、たしかに200uMになり濃度が高すぎます。 20pmol/2mLになるのは16時間して取り込まれた後の細胞を元の培養状態に戻すときの条件です。 6穴のwellに100uLのmxiutreをtrasfectするのはちょっとおかしい気はしますし、このやり方ではlipo2000そのものの濃度が高すぎるのでsiRNAの非特異効果+lipo2000そのものの毒性が２重に働いてる気がします。 そのprotocolはたしかになんかおかしいです。 ノックダウンした細胞で目的の分子以外のcontrolも下がったりしてませんか? なお自分は　 非特異的な効果に悩まされたとき使っていたLipo2000から 最近ではLipofectamineRNAimaxに変えて実験をしてます, 試薬自体の毒性も低いし使用するsiRNaの濃度もLipo2000の1/10ぐらいで済むので非特異的な効果はほとんどおきずコストも安くつくのでいいとこずくめです、もし興味があるなら試されては?ただastrocyteで使えるかどうかは不明ですが。

(無題) 削除/引用 No.425-2 - 2007/10/31 (水) 01:01:03 - りょう 僕の算数能力がおかしいのでしょうか？そのプロトコールでは20pmol/2ml使用しているからfinal 10nMではないでしょうか？ 10mMはちょうどいい感じの濃度だと思います。

siRNAの非特異的阻害？ 削除/引用 No.425-1 - 2007/10/30 (火) 21:08:40 - ポロン 現在、lipofectamine 2000を用いて、siRNAである遺伝子をノックダウンしようとしています。しかしながら、なかなかうまくいきません。ノックダウンしようとしているのは、以下のプロトコールと同じアストロサイトです。 http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/11668009.pdf まず、液量100μLというのが信用できず、メーカーに問い合わせたところ、濃度が変わらなければ液量は増減してもよいとのこと。200μLで試しています。ノックダウンは起こっているようなのですが、ランダム配列を導入したものでもノックダウンが起きているようなんです。 再び、メーカーに問い合わせたところ、50μM以上では非特異的なノックダウンが起こると言われました。そこで、プロトコールの濃度を計算してみると200μMでした。なぜ？ これは、非特異的なノックダウンが起きているのでしょうか？それとも、手技的なものなのでしょうか？ このような経験がおありの方、詳しい方ご教授お願いいたします。

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