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EMSAでプローブが分解されてしまう トピック削除
No.423-TOPIC - 2007/10/30 (火) 19:11:53 - taka
こんにちは。ある腫瘍細胞に抗癌剤でアポトーシスを誘導する実験を行なっています。アポトーシスの機序としてNFKB経路の抑制が考えられたので、EMSAでみてみたいと考えています。抗癌剤で未処理の腫瘍細胞核抽出液とNFkBコンセンサスシークエンスのEMSAでは、プローブのシフトが観察されました。ところが、抗癌剤処理後のEMSAでは、プローブが分解されているようで、フリーのプローブを含めてプローブのシグナルが全体に著しく低くなってしまいました。
アポトーシス細胞ですので、DNaseなどがでまくってプローブを分解してしまっているのかなと考えています。反応液のEDTAを増やしたり、ATAというDNaseの阻害剤をいれてみたりしたのですが、EDTAの増量はあまり効果的ではなく、ATAはDNase活性は阻害するものの、プローブとNFKBの結合も抑制してしまいました。
何か良い対策はありませんでしょうか。

ちなみに核成分抽出はピアースのキットを使い、プローブはビオチン標識で化学発光系で検出しています。

いろいろなご意見をお聞かせいただけると幸いです。
　
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ありがとうございます 削除/引用
No.423-5 - 2007/10/31 (水) 16:17:55 - taka
みなさん、アドバイスありがとうございます。

＞- ~さん
大変良い考えだとおもいます。早速、手元にあるirrelevantなオリゴを使って試してみたいと思います。

＞おおさん
いろいろとコメントありがとうございます。
＞少し違う観点でNFKB-リポーター(ルシフェラーゼとか)のプラスミドを使って活性化を見てみるのも良いかもしれません。
残念ながら使用している細胞は24時間以上vitroで培養することが難しいので、transfectionを含む実験は難しい気がしております。違う視点からのアプローチを試してみることは吝かではないのですが。
＞アポトーシスの刺激で転写因子を見ているペーパーを参考にするのがいいかと思いますが、きっとかなりあると思いますよ。NfKb見ているのも見つかるようなきがします。
確かにそうですね。もうちょっと文献的にも調査してみたいと思います。

＞カナマイシンさん
＞・DNA-蛋白複合体形成反応の時間を短くする。
＞・同上、反応の温度を下げる（4°Cとか10°Cとか）→この場合は泳動も低温でやるとbetter。
このあたりは結構試してみていて、実際反応はon iceで、泳動層も氷水で冷やしつつやっています。確かにタンパク質、DNA等の分解が問題となっている場合には、反応温度を下げるのはかなり有効な手段みたいですね。生体内よりもかなり低い温度でこういった反応がみられるのがちょっと不思議なような気もいたしますが。

(無題) 削除/引用
No.423-4 - 2007/10/31 (水) 10:38:42 - カナマイシン
ベタな話ですが、
・DNA-蛋白複合体形成反応の時間を短くする。
・同上、反応の温度を下げる（4°Cとか10°Cとか）→この場合は泳動も低温でやるとbetter。
で劇的に良くなったことがあります。

もちろんそれで結合が悪くなってしまう場合もあるのかもしれないですが。
逆に言えば上記条件がまったく結合に影響を与えないように見えることもしょっちゅうあります。

どちらかと言えば温度の方が効果がありそうかな？

(無題) 削除/引用
No.423-3 - 2007/10/31 (水) 05:02:38 - おお
DNaseが活性化して恐らくゲノムが分解されようとする中でNFKBの活性化が何を意味しているのかと言うのが少し気になったところです。たしかに何か新たな可能せいがあるかも知れませんが、、、そういう意味では少し早い段階低いドースで見られた方がスッキリするかなと思いました。もしNFKBがcaspaseの経路と関係ないという話であればcaspase inhibitor存在下でもいいかもしれません。しかしこれは実験によるので１度よく考えてから実験を組む方がいいかもしれませんね。
核抽出の方法は工夫する手があるかも知れませんが、ピアスのキットについて詳しく存じ上げていませんのでなんとも言えません。核抽出の段階でEDTAとか使うと言うことぐらいでしょうか、、あとEGTAとか、、
少し違う観点でNFKB-リポーター(ルシフェラーゼとか)のプラスミドを使って活性化を見てみるのも良いかもしれません。
あとはアポトーシスの刺激で転写因子を見ているペーパーを参考にするのがいいかと思いますが、きっとかなりあると思いますよ。NfKb見ているのも見つかるようなきがします。

(無題) 削除/引用
No.423-2 - 2007/10/30 (火) 19:45:02 - ~
全くの門外漢ですが、適当なゲノムDNAをソニケーションし、
それをプローブの100倍量位入れるというのはいかがでしょうか。

プローブとNFκBとの結合性に特異性があるのであれば、
コールドのゲノムDNAを100倍量入れても結合には余り影響しないかもしれません。

EMSAでプローブが分解されてしまう 削除/引用
No.423-1 - 2007/10/30 (火) 19:11:53 - taka
こんにちは。ある腫瘍細胞に抗癌剤でアポトーシスを誘導する実験を行なっています。アポトーシスの機序としてNFKB経路の抑制が考えられたので、EMSAでみてみたいと考えています。抗癌剤で未処理の腫瘍細胞核抽出液とNFkBコンセンサスシークエンスのEMSAでは、プローブのシフトが観察されました。ところが、抗癌剤処理後のEMSAでは、プローブが分解されているようで、フリーのプローブを含めてプローブのシグナルが全体に著しく低くなってしまいました。
アポトーシス細胞ですので、DNaseなどがでまくってプローブを分解してしまっているのかなと考えています。反応液のEDTAを増やしたり、ATAというDNaseの阻害剤をいれてみたりしたのですが、EDTAの増量はあまり効果的ではなく、ATAはDNase活性は阻害するものの、プローブとNFKBの結合も抑制してしまいました。
何か良い対策はありませんでしょうか。

ちなみに核成分抽出はピアースのキットを使い、プローブはビオチン標識で化学発光系で検出しています。

いろいろなご意見をお聞かせいただけると幸いです。
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