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(無題) 削除/引用 No.421-7 - 2007/11/02 (金) 07:17:46 - おお 膜表面をプロテアーゼで処理して見ると分かることがあります。2本になるか、末端が削れるかです。そういう意味では真ん中にタグをつけてみてもいいかもしれません。または膜貫通部分を何か抗体が認識する貫通ドメインに帰る手もありますが、ちょっと人工的すぎるので慎重な方法を取らないと行けないかもしれませんね。あと膜貫通ドメインがアルファーヘリックスのばあい、膜貫通ドメイン末端近傍の電荷が膜の外か内かを決める一つのファクターだと考えられています。予測もそれに基づいていると思います。molecular biology of the cellにもその辺のことは書かれていますので参考にされるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.421-6 - 2007/10/31 (水) 14:42:22 - DNAI 以前複数回膜貫通タンパクを追っていた際、細胞膜上のタンパクだったにもかかわらず、細胞内に大多数が局在していました。強制発現系による局在の同定は解釈に困ると感じております。さて、C末タグで検出がうまくいかないというのは抗体に起因するのでしょうか？もしN末と同種のタグを用いているのならば、これこそ切断されている可能性はないでしょうか？また、切断の可能性を探るには、培養上清のタグ抗体によるIPはいかがでしょう？FLAGタグならば免沈キットもありますのでお手軽ですよ。

(無題) 削除/引用 No.421-5 - 2007/10/31 (水) 11:18:57 - Ｔ > シグナル配列がない場合におけるN末タグがトポロジーの異常に関わってくる可能性はどのくらいあるのでしょうか？ 明らかなシグナル配列がなくても、やはり膜を通過する際にはＮ末の配列が大事でしょうし、タグを付けてしまえばトポロジーが破壊される可能性は大きいと思います。Native な蛋白に対する抗体を作成するのがベストだとは思いますが、次善の策として蛋白の内部、例えば膜貫通領域の前後にタグを入れてみてはいかがでしょうか。 > N末の膜貫通領域以前は５０アミノ酸くらいなのですが何らかの理由でFACSでは確認できない状態にあるという可能性はあるのでしょうか？ 例えば細胞外に出たら切り離されてしまうとか。

(無題) 削除/引用 No.421-4 - 2007/10/31 (水) 10:40:49 - 膜タンパク 早速のレスポンスありがとうございます。 教えていただいたプログラムで予想するとU字型という答えが返ってきました。 現在、私の持っている結果では、 １、免染では確かにタグ抗体で染めると膜に局在が見られること ２、SignalIPによる予想ではシグナルシークエンスがないということ です。 タグはまさにN末端につけています。指摘のとおりタグによる局在の破壊については私も不安がありC末にタグをつけた物も作製したのですが、どうしてもウエスタンでC末融合タンパクを確認できない（タグのつなぎ目はシークエンスで確認済み）ためN末融合型を使用しています。これも理由はわからないままなのですが、タグを変えるなりもう少しトライしてみようと思います。 シグナル配列がない場合におけるN末タグがトポロジーの異常に関わってくる可能性はどのくらいあるのでしょうか？ N末の膜貫通領域以前は５０アミノ酸くらいなのですが何らかの理由でFACSでは確認できない状態にあるという可能性はあるのでしょうか？ 市販でこの分子に対する抗体がないためにタグ付きでやりたいのですが、何かご存知でしたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.421-3 - 2007/10/30 (火) 16:02:39 - Ｔ Ｎ末にタグを付けたとのことですが、本当のＮ末端（つまり最初のメチオニン）の部分に付けたわけではないですよね？もしそうなら、シグナル配列があったとしても破壊されてしまいますし、トポロジーも異常になるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.421-2 - 2007/10/30 (火) 15:55:49 - Ｔ http://www-btls.jst.go.jp/Links/link.cgi?category=48 などである程度予測できます。 Ｎ末にシグナル配列らしきものがあれば、Ｕ型の可能性が高いでしょう。 Ｎ末抗体で染まらなかったとの事ですが、triton 処理で染まってきたものが膜表面にあるのは確かですか？強制発現した蛋白が細胞内でアグって膜表面に出てこないのはよくあることです。

膜タンパクの向きの決定方法 削除/引用 No.421-1 - 2007/10/30 (火) 15:40:13 - 膜タンパク 現在、２回膜貫通型のタンパクについて研究をしています。 そのタンパクがどちら向きに（U字または逆U字）に膜状に発現しているかを知りたいのですが、アミノ酸配列を見ただけどもそれはわかるのでしょうか？ N末にタグをつけてタグに対する抗体でFACSをしてもシグナルは見られませんが、固定＋Triton処理したサンプルではシグナルが見られます。この結果から逆U字だと考えているのですが、ある文献ではそのタンパクはU字状に発現していると報告されています。 この問題を解決する良い方法をご存知の方おられないでしょうか？

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