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(無題) 削除/引用 No.420-5 - 2007/10/31 (水) 00:04:42 - tak seara, TK-1さんコメントありがとうございます。 抗体濃度は取りあえずプレ実験1回目は１マイクログラム／mlで行いました。（論文でもこの濃度での使用が多かったので） TK-1さんが仰るとおり20, 50, 100は有り得ないと思います。 現在2回目の実験で0.1, 0.33, 1, 3とふって検討中です。（J.immunology2007, NFATc1　の論文でもこの辺の濃度で使用しているので）明日以降に増殖度合いを見てみます。 これで駄目ならCD3とCD28抗体両方がコートされたビーズを購入しようと考えてますが使用経験おありですか？？？

(無題) 削除/引用 No.420-4 - 2007/10/30 (火) 21:17:40 - TK-1 >[Re:3] TK-1さんは書きました : > >[Re:2] searaさんは書きました : > > 濃度はどれくらいでしょうか？ > > 予備実験で濃度をふってみてからの方が良いかと。 > > CD3だけでも濃度が濃ければ刺激が入ったり増殖するものです。 > > 私は予備で10ug,25ug,50ug,100ug/mlと振って予備をして結局50ug/ml eachCD3+CD28/PBSで実験してました。固定は４℃ONです。 > > 2回PBS washは同じ。 > こんなに高い濃度が必要なら他にも問題があるんじゃないですか？ > もしcommercialの生成抗体(2C11 途中で送信してしまいました。失礼。 つづきです。 commercialの抗体(2C11+37.51)などなら1ug/ml程度で十分な増殖が得られるはずです。50ug/mlはかなりの量です。coatingは37度一時間か４度O/Nです。azide-freeの抗体ならwashには神経質になる必要はありませんし、azide入りでも２回も洗えば問題ないでしょう。 24well plateで上記の濃度の抗体を250ul/well程度でcoatingしています。

(無題) 削除/引用 No.420-3 - 2007/10/30 (火) 21:12:03 - TK-1 >[Re:2] searaさんは書きました : > 濃度はどれくらいでしょうか？ > 予備実験で濃度をふってみてからの方が良いかと。 > CD3だけでも濃度が濃ければ刺激が入ったり増殖するものです。 > 私は予備で10ug,25ug,50ug,100ug/mlと振って予備をして結局50ug/ml eachCD3+CD28/PBSで実験してました。固定は４℃ONです。 > 2回PBS washは同じ。 こんなに高い濃度が必要なら他にも問題があるんじゃないですか？ もしcommercialの生成抗体(2C11

濃度の予備実験 削除/引用 No.420-2 - 2007/10/30 (火) 19:44:59 - seara 濃度はどれくらいでしょうか？ 予備実験で濃度をふってみてからの方が良いかと。 CD3だけでも濃度が濃ければ刺激が入ったり増殖するものです。 私は予備で10ug,25ug,50ug,100ug/mlと振って予備をして結局50ug/ml eachCD3+CD28/PBSで実験してました。固定は４℃ONです。 2回PBS washは同じ。 ただ、これではないですがELISAのときに、ほんとは吸着にいいのはPH7ではなくPH8くらいがいいので、PBSではなく１M NaOCO3(PH8.0)で抗体希釈してつけていました。 なお、これらの予備のときには反応が見れればよくCD４、８分取にかける時間も試薬ももったいないので、脾臓でもリンパ節でもそのままで捲いてしまってかまいません。

ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激（固相化法） 削除/引用 No.420-1 - 2007/10/30 (火) 13:47:01 - tak primary T cellにCD3/28抗体の共刺激を入れる際、抗体をプレートに固相化していますが、増殖が上手く惹起できません。固相化法はPBSに希釈した抗体溶液をプレートに添加して室温4時間および一晩後、2回PBS washしただけです。何か吸着試薬を使用すべきなのでしょうか？ 同じ時に調製した細胞をPMA/ionomycin処理したものは増殖していますので細胞の方は問題ないかと思います。 コメント宜しくお願いします。

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