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(無題) 削除/引用 No.417-5 - 2007/11/09 (金) 12:39:43 - カエル Bostonさん、コメント有り難うございました。 今回の実験を始めるにあたり、ChIP-IT Expressの使用も考えていました。今回、再度キットのプロトーコールを読み返してみました。しかし核分画の抽出までは基本的に今まで行ってきた方法と代わらないので、私が使っている細胞では上手く核分画を調製出来ないと考えられます。今はChIP-reChIPを行って問題を解決しようと考えています。 さて、新たな疑問が有ります。ChIP-IT Expressのプロトーコールにも載っていますが、核抽出物を用いた場合は超音波より酵素によるDNA切断を推奨しています。今回の条件設定の中で、核抽出物を超音波で破砕すると、細胞全抽出物を用いたときよりもDNAが切断効率が低下してしまいました。何故この様な現象が生じるのか不思議でなりません。誰かこの現象を説明できる方はおられないでしょうか？

ChIP-IT Express 削除/引用 No.417-4 - 2007/11/06 (火) 00:25:08 - Boston I haven't checked purity of nuclear fraction, but you can try ChIP-IT Express from ActiveMotif.

固定した細胞からの核分画抽出 削除/引用 No.417-3 - 2007/11/03 (土) 10:26:26 - カエル 通りすがりさん、コメント有り難うございました。 いろいろプロトコールを調べたのですが、固定された細胞から核を取り出すのは難しいようです（細胞の種類に依存するのでしょう）。試しにNP-40溶液に溶かした後、ダウンスホモジナイザーで処理しましたが、あまり効果は見られませんでした。また細胞を固定後、トリプシン処理も加えましたが、やはり無理なようです。あとはNP-40の濃度を高くするなど、それ以外のパラメーターをいじくってみます。

(無題) 削除/引用 No.417-2 - 2007/10/30 (火) 09:49:39 - 通りすがり 界面活性剤や低塩濃度などの条件下でincubateしても 細胞の種類によっては一度固定した後でも核抽出は一応行えますが、基本的には通常と異なり固定し架橋反応を起こさせると抽出しにくくなることが多く、 その場合は物理的にpestleなどを用いて細胞を破砕するのが割りとChIP などでは良く使われます、 ただ手技の特性上、それぞれの実験者が経験的に条件を定めなければならないのでちょっと慣れるまでいろいろやる必要がありますね。 慣れてる人などがまわりにいたら直接見せてもらって 教えてもらってほうがいいでしょう、一人でやるとなかなか感覚的にわかりにくいし、参考書やこういうタイプの掲示板から得られる情報では伝わりにくい部分があるので。

固定した細胞からの核分画抽出 削除/引用 No.417-1 - 2007/10/30 (火) 07:32:27 - カエル 私が解析しているタンパク質は通常細胞質に存在し、細胞外からシグナルが入ると核移行してDNAに結合します。 現在、このタンパク質の標的遺伝子の解析のためにChIP assayを行っています。 ChIPのプロトコールには、全細胞の抽出物を用いるものと、核分画を抽出して用いる物があります。 出来れば後者の核分画を抽出する方法でChIPを行いたいと考えています。 しかし、Formaldehydeで固定した細胞を0.5% NP-40 bufferで処理しても、顕微鏡下で細胞膜が残っており、核分画を抽出することが出来ません。 もし、Formaldehydeで固定した細胞からの核分画抽出法をお知りの方がおられましたらご教授願えないでしょうか。

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