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横さんありがとうございます！ 削除/引用 No.409-10 - 2007/10/30 (火) 12:19:19 - Hiro 今回はいろいろアドバイスをしていただいてありがとうございました。 横さんのアドバイスを参考にして、実験をこれからやってみます。 本当にありがとうござました。

(無題) 削除/引用 No.409-9 - 2007/10/30 (火) 12:11:44 - 横 最高スピードで１分間くらいやってます。長くても大丈夫です。 可溶化しているタンパク質は沈殿しません。逆に言えば、遠心で沈殿するような凝集塊であればゲルに入って行きません。

横さんへ 削除/引用 No.409-8 - 2007/10/30 (火) 12:00:50 - Hiro アドバイスありがとうございます。 少し疑問点が有るので確認の意味で確かめさせてください。 横さんはSampling Buffer(SDS入り)をサンプルに入れて、素早くボイルし、そのサンプルを遠心してアプライしているとのことですが、遠心の設定条件はどのくらいでしょうか？ 遠心をしすぎるとすべてのタンパクが沈殿してしまいそうで、少々ビビっています。 これもタンパクによりけりだとは思いますが、横さんの実験での条件を教えていただければ幸いです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.409-7 - 2007/10/29 (月) 22:24:53 - 横 遠心してます。細胞壁なんかはSDSでは溶けないので。 私の「すぐに」は、傍らに沸騰水を用意しておいて、均一に懸濁されてから10秒以内でしょうか。懸濁に時間が掛かるのも避けたいので、上清を除いた細胞塊を予めボルテックスして緩めておいて、その後にSDS dyeを入れてさらにボルテックスしています。 これは、SDS dyeを中途半端に効かせると膜系が壊れて、液胞から漏れ出たプロテアーゼによってタンパク質が分解されることを防ぐためです。 どれくらいすばやくボイルすべきかは、タンパク質に拠りけりだとは思います。

横さんへ 削除/引用 No.409-6 - 2007/10/29 (月) 21:31:12 - Hiro さっそくの書き込み有り難うございます。 となると、横さんの実験方法としては、ボイル後に上清を「遠心しないで」とっているのでしょうか？ また、Sampling-bafferを加えて「すぐにボイルをする」とアドバイスを頂きましたが、具体的にどのくらい（何秒）位を目安にすれば良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.409-4 - 2007/10/29 (月) 18:14:34 - 横 タンパク質濃度が濃すぎて十分にSDS化仕切れなくって沈殿しているのではないでしょうか。 分子量にも依りますが、80kDa程度より小さな細胞質のタンパク質ならば、菌体に直接１ｘSDSバッファーを加えて懸濁し、すぐに（これがコツ）ボイルして上清を取れば、ほとんどロス無く簡単にサンプルを調製できますよ。

aさんへ 削除/引用 No.409-3 - 2007/10/29 (月) 15:12:34 - Hiro aさんへ＞ 確かによくよく考えたら溶け残りなのかもしれませんね。 とりあえず、タンパクを再懸濁する際は100μlのPBSに溶かしているので、もう少しPBSの量を増やした方が良いのかもしれません。 以前は、溶け残りのあるサンプルは上澄みだけ取ってアプライし、溶け残りのないサンプルはそのままアプライをして、Westernの結果を見ると一応揃ったタンパク量が確認できたのですが、このような方法はあまり良くないのでしょうか？ また、今後も溶け残りを除く上清だけアプライしようと思っているのですが、aさんはアプライする前に遠心をかけていますか？ もし、かけているのなら条件を教えていただきたいです。 それではよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.409-2 - 2007/10/29 (月) 12:07:56 - a PBSで再溶解した時の溶け残りですかね？ いずれにせよ、沈殿物はゲルの中を通れないと思います。 綺麗に泳動したい時は上澄みをアプライしますし、確認程度ならそのまま泳動しています。

酵母のタンパク抽出後のSDS-Pageのアプライ方法に関して。 削除/引用 No.409-1 - 2007/10/27 (土) 21:09:44 - Hiro 現在薬剤を酵母に処理して、あるタンパク質の発現がどのようになっているのかを見るためにWestern-blottingで解析を行っています。 最近ではNaOH法でのタンパクの抽出が難しいので、ガラスビーズを用いてタンパクを抽出して、ブラッドフォードでタンパク量を測定してからSDS-Pageへアプライしています。 （手順は以下の通りです） 1.酵母にガラスビーズと20%TCAを加え、低温室で1時間vortex. 2.遠心後、5%TCAに懸濁. 3.遠心後、PBSに懸濁し、上澄を新しいエッペンに移す. 4.ブラッドフォードでタンパク量を測定. 5.サンプルと同量のSampling Bufferを加え、ボイル後、ゲルにアプライ. そこでどなたか詳しい方にお聞きしたいのですが、最後のゲルにアプライする段階でサンプルが沈殿と上澄みに分離するという事が良く見受けられるのですが、このような場合は上澄みだけアプライすれば良いのでしょうか？もしくはピペッティングなりボルテックスをかけて、懸濁状態にしてからアプライをした方が良いのでしょうか？ 自分の研究室にガラスビーズで抽出を行っている人がいないので、なかなか聞きたくても聞けない状況にあるので、どなたかに教えていただければ幸いと思っています。 どうかよろしくお願いします。

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