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(無題) 削除/引用 No.407-12 - 2007/11/01 (木) 23:09:57 - MOAOL そば様、とおりすがり様、AP様、おお様 御礼が遅れまして大変失礼致しました。 有益な御助言ありがとうございます。 Ca入りのバッファーは まだ試しておりませんが 近い将来実施してみます。 BTフォーラムは本当に困ったときに拝見し、 勉強させてもらっています。 皆様のように、 いつか私も誰かに助言できるよう精進したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.407-11 - 2007/10/30 (火) 11:14:58 - おお >ひょっとしたらMgよりMnを加えたら良いかなと思ったのですが（Mgではnicking、Mnではdouble strand breakが起こる）、そばさんのCa説を読んで、ちょっと調べてみたら、なるほどです。 あ、先越された、、これ書こうかなと思ってたんです。Mnはダブルストランドで切断するのできっと効果的だろうなと思っていました。実績という意味では分からないのですが、プロメガのバッファーはMnを含んでます。添付文書にCaのことも書いていますので参考になるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.407-10 - 2007/10/30 (火) 11:11:16 - AP ひょっとしたらMgよりMnを加えたら良いかなと思ったのですが（Mgではnicking、Mnではdouble strand breakが起こる）、そばさんのCa説を読んで、ちょっと調べてみたら、なるほどです。 成書にもMgとCaが共存すると（それには10 mMと0.1 mMとありましたが）単独のときよりも相乗的な活性が得られると記述しているものがありますね。 （↓ネタものとはこの論文らしいですが、活性のことはあまりふれていないような） http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/247/9/2895 私は、RT-PCRのときなどにはPromegaのRQ DNaseを使ってきたのですが（今はそんなことないと思うけれど、一昔まえはRNase-freeと称していてもRNaseが微量のRNaseがコンタミしていることが多く、唯一これだけが信用出来るというウワサだったので）、今カタログを調べてみると、この製品の添付反応バッファーにはCaが入っていますね。Takaraでも最高級のRNase-free DNase I（recombinant)には、Ca入りの反応バッファーをつけていますね。

(無題) 削除/引用 No.407-9 - 2007/10/30 (火) 00:54:17 - 通りすがり 解決済みのところにコメントしてしまい、申し訳ないのですが、ちょっと気になる点があったので… というのは DNaseで完全に分解することにこだわる必要はあるのかな？ とふと疑問に思ったのです。 確かに、RT(-)のサンプルをネガティブコントロールとして捉えると、シグナルが出たことは問題かもしれませんが、バックグラウンドのようなものとして捉えて引き算すればそれほど問題にはならないのではないでしょうか？ 他の識者の方の見解はいかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.407-8 - 2007/10/29 (月) 23:47:06 - そば ちなみにin vitro転写後とDNaseI処理後は、それぞれTRIZOL等でRNA精製を行った方が良いです。精製を手抜きするとろくな目に遭わないですから。

反応バッファーにCa2+が足りない？ 削除/引用 No.407-7 - 2007/10/29 (月) 23:36:22 - そば まぁ、騙されたと思って試して頂きたいのですが。 少なくともTAKARA、RocheのDNaseIでは効果のあることを確認しているので、同じくBovine pancreas由来のInvitrogenでも効果があると思うのです。 DNaseI反応バッファーを添付のものではなく、 40mM Tris/HCl pH8.0、8mM MgCl2、1mM CaCl2、5mM DTT を使用してください。 一応、理屈っぽく言うと、Bovine pancreas由来のDNaseIはMg2+の他にCa2+を補因子として必要とするにも関わらず、反応バッファーには全く含まれていないところに問題の根本があります。某メーカーに問い合わせたところ「酵素保存液に入っており、反応バッファーには必要無い」そうですが、そのメーカーは（MOAOLさんがプラスミドの消化を電気泳動で確認したように)ゲノムDNAなどが電気泳動で見えなくなる程度の活性しか保証しておらず、そもそもRT-PCRでの検出が不可能になるまでの完全消化は保証外のようでした。 そこで私が実際にCa2+を反応バッファーに添加してみたところ、非常に良好な結果を得た・・・というのが根拠になっています。 Invitrogenの反応バッファーも確認しましたがほぼ同様の組成ですので、同じ起源の酵素である以上、効果がある可能性が高いと思います。 私も全く同じことで相当時間を無駄にしましたが、上記の反応バッファーを使用するようにしてから、ほぼ完全にプラスミドDNAを消化出来るようになりました（RT-PCRで35サイクル以上）。もし、良ければ試してみて、効果を教えて頂ければと思います。 ちなみに、確かにもう少し要約して質問出来るとは思いますが、その質問の仕方に同じ苦労をした人の努力が滲んでるのが分かるので、私は嫌いではありませんよ（笑

ありがとうございました。 削除/引用 No.407-6 - 2007/10/29 (月) 22:22:46 - MOAOL う〜んと様、おお様、とおりすがり様、そば様 大変有益な御助言を頂き、本当にありがとうございました。 本日、上司と相談して次の一手を打つ予定となりました。 TRIZOL での精製をまず試してみたいと思います。 また、だらだらと質問文を書いてしまい 申し訳ありませんでした。 それでもなお御回答頂いた皆様に、重ねて感謝致します。 DNaseI はInvitrogen のAmp.grade を使用しています。 先週末、のべ3 回目の処理をやりましたが、 完全消化できなかったようです。 大変ありがとうございました。 良い結果が得られるよう努めます。 失礼します。

(無題) 削除/引用 No.407-5 - 2007/10/29 (月) 11:35:30 - そば 他の方が仰られているようにDNase処理が不十分で、鋳型になり得るDNAが残っているのだと思います。 が、これを完全に消化するのは結構難しいんですよねぇ・・・。 （ダメなときは2回やっても、オーバーナイトにしても完全消化しない） 一応お尋ねしますが、どこのメーカーのどの試薬を使っていますか？

電気泳動でバンドが見えなくても 削除/引用 No.407-4 - 2007/10/28 (日) 11:12:33 - とおりすがり リアルタイムPCRは電気泳動等では確認できないレベルの核酸量を定量することができる手法ですので、DNase処理後電気泳動でバンドの有無を確認しただけで「DNAは完全に分解した」というのは不十分です。 26サイクルから増幅した、ということですが、感覚的に多分1,000コピーぐらいがその反応液の中に入っているのでは？と思います（ケミストリによって立ち上がりのサイクル数は前後しますので、あくまでも感覚的なものですが） 仮にプラスミドのサイズが3kbだったと仮定すると、1,000コピー=数fgしかないので、電気泳動でバンドが見えないのは当然です。 このため、別の方がご記入されていらっしゃるように、さらにDNAを除去する過程を追加することが必要な状況だと思います。

(無題) 削除/引用 No.407-3 - 2007/10/28 (日) 03:47:43 - おお ようするのDNAが未消化と言うことでしょうね。1コピーあってもPCRは増幅されますので、電気えいどうで検出されなくても、検出に十分量のDNAが残っている可能せいがあると思います。cRNA合成後DNAがなるべく取り除けるような精製法を取った方がいいかもしれませんね。trizolなどを使う方法は酸性条件でDNAをなるべくフェノール相に取り込もうという方法ですし、DNase処理のあとに組み合わせて使うといいかもしれません。あとはサイズでまず精製し、念のためにDNaseを使う方法もあるかもしれません。サイズによる精製はUrea存在かでPAGEをするか、クロンテックが売っているゲル濾過のスピンカラムとかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.407-2 - 2007/10/27 (土) 16:18:10 - う〜んと もうちょっと要約して質問されたほうがよろしいんじゃないでしょうか。 cRNA溶液でもPCRがかかるのなら、鋳型にしたDNAが分解されないで残っているということでしょう。 たまたまターゲット領域が切れ残りやすい構造をとるのかもしれません。 >●RNA もDNA も分解しているはずなのに >なぜ増幅されてしまうのでしょうか？ >（DNaseI の活性はプラスミドの消化で確認してあります） これはPCRで確認したということですか？ 他の方法（電気泳動など）で見えなくても、PCRでの増幅は起こりますよね。

DNase してもRNase してもPCR増幅される？ 削除/引用 No.407-1 - 2007/10/26 (金) 23:30:02 - MOAOL 絶対定量法でリアルタイムPCRをしています。 検量線を作成する際に in vitro転写でcRNA を調整して superscriptII でcDNA 合成をしています。 逆転写のコントロール（−RT; 酵素加えず）を リアルタイムPCR にかけたところ シグナルが検出されてしまいました。 （サイクル数26 くらいで立ち上がる） なお、 cRNA を合成したあとにDNaseI 処理（プラスミド消化）をし RT したあとにRNase H 処理（鋳型RNAを消化）をしてあります。 逆転写酵素を入れていないので、cDNA は無いはずです。 おかしいな、と思って 上記の−RT液（DNase, RNaseH処理済, RT酵素無し）、さらに まだ逆転写をしていないcRNA溶液(DNase処理済み）のそれぞれに RNase A を加え、37℃20min をしました。 これらをテンプレートにして、リアルタイムPCR したところ やはりシグナルが検出されました。 melting curve はシングルピークで どちらも同じ波形です。 なお、リアルタイムの増幅産物は未泳動です。 なにもテンプレートを入れていないブランクは シグナルは検出されていません。 （水、プライマー、試薬は同一。コンタミは無い） ●RNA もDNA も分解しているはずなのに なぜ増幅されてしまうのでしょうか？ （DNaseI の活性はプラスミドの消化で確認してあります） 同じような経験、対処法、 考えられる原因、コメントなどありましたら どうか御意見頂けませんでしょうか？ 宜しくお願い致します。

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