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(無題) 削除/引用 No.405-9 - 2008/02/25 (月) 18:42:57 - O お返事が遅くなりまして申し訳ございません。 いくつかのご意見を参考に実験を進めております。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.405-8 - 2007/11/10 (土) 20:56:48 - おお あ、そうだ。もう一つ。そのリコンビナントに蛍光色素をあとでクロスリンクするのもてかもしれません。あとは特殊なコドンを導入して蛍光色素をもつアミノ酸をin vitroのタンパク合成の時に取り込ませるという方法もあります。蛍光色素がついていると楽ですからね。

(無題) 削除/引用 No.405-7 - 2007/11/10 (土) 20:51:17 - おお 結局免疫染色とか、蛍光たんぱく質の融合タンパクでの局在というのは考えた方がいいと思います。たしか短い、ある色素に特異的結合するタグが最近売り出されているようです。それを使うと、色素を後でふりかけ洗えば、局在を見ることができると思います。あと特異的抗体を使うなら、内在性のものが引っ掛らないぐらい発現が弱い細胞を探すとか、KO由来の細胞を手に入れるとか、KDで染まらないぐらいに発現を落とせるとか、タンパクの合成を阻害して発現を止めてみるとか、検討できることはあると思います。もし抗体の特異性が生物種で違うものが得られるなら(とくにモノクロとか)異種の細胞でやってみるのもいいかもしれません。また、内在性のものと、外からかけたもので局在が一致すると考えていますでしょうか?染色して、しないという結論であれば内在性のものは染まってもOKと考えてもいいかもしれません。 Hisの抗体は弱い印象があるのと、特異性という意味でマンマルの細胞で使うのは怖いと思います。ただキアーゲンがN末His抗体とかいろいろ出しているので、使えるものがあるかもしれません。 免疫染色はこの場合かなり欲しいデーターですが、実験のアプローチとしては多角的にやっていくのがいいと思います。例えば細胞内で結合するパートナーとか見つかってますか?そのタンパク質添加後、細胞外の物を十分に取り除けるといった条件下で、IPか、Hisよう金属アフィニテェーレジンとかでプルダウンしてみてはどうでしょうか。あるいはパートナーのたんぱく質の抗体を使うか、そのタンパクをFLAGとかタグをいれ、プルダウンし特異的抗体を使ってウエスタンし、HIStagのため内在性の物とサイズが違えば区別がつきますし。パートナーを見つけるのであればYeast-two-hybridでスクリーニングでもいいかもしれませんね。あるいは網羅的に解析したデーターベースに含まれてるかもしれません。 パートナーが分からなければLysateからHIS用レジンで精製し、マスで解析してしまっても良いと思いますし、それで細胞ないに存在するたんぱく質が有意に得られるなら、細胞内での機能の可能せいを主張できます。 あと、活性として何を期待していますか?細胞ないのその活性を使って検出できる可能性もあるのかなと思います。 いろいろ書きましたが、各実験に関してはそれぞれ慎重に進めることが必要ですが、それぞれの方法論をよく見てから実験を進めることをすすめます。

(無題) 削除/引用 No.405-6 - 2007/11/09 (金) 20:14:54 - tak Hisは精製用だと思うのですが、検出用にもう一つタグを（FLAG等）付けるのはどうでしょう？ あとは多少のアーティファクトを覚悟でGFPを付けてみるとかですかね？

ありがとうございます 削除/引用 No.405-5 - 2007/11/09 (金) 19:20:11 - O お返事が遅くなり申し訳ございません。 アドバイスありがとうございます。それぞれ参考にさせて頂きたいと思いますが、 >モノクロ様 免沈はHis-tag抗体でということでしょうか？ >T様 添加タンパクに対する抗体での免染は行ってみたのですが、培養系に添加しているタンパクは細胞内にもごく微量発現していることがあるので、免染では違いが分かりません。 His-tag抗体での免染というのは行ったことはないのですが、できるのでしょうか？？？ >hjhjk様 エンドサイトーシスの実験を参考にするのはいいかもしれません。特に膜結合と細胞内に取り込まれているものを区別して調べたかったので試してみます。

Endocytosisの実験を参考にするといいかも 削除/引用 No.405-4 - 2007/10/26 (金) 12:06:57 - ｈｊｈｊｋ エンドサイトーシスの実験などでは、 細胞表面に結合しているが取り込まれて いないタンパク質を取り除くために、 0.2M Na-acetate(pH4.0), 0.5M NaClなどでon ice 2minとか洗浄してから 細胞を回収して解析してます。 　さらに、on iceでは細胞へのエンドサイトーシスがほとんど 起こらないことを利用して、on iceでリコンビナントタンパク質と インキュベートしたものをネガコンとしていたりします。 　Ｏさんの実験に合うか分かりませんが、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.405-3 - 2007/10/26 (金) 10:20:47 - Ｔ 免染がいいんじゃないでしょうか。 permeabilize しない細胞とした細胞とを比較して、前者でシグナルが見られず、後者で見られれば、細胞内部に蛋白が取り込まれているということになります。

(無題) 削除/引用 No.405-2 - 2007/10/26 (金) 10:05:51 - モノクロ 取り込まれると量はそれほど多くないですよね？だとすると直接Ｌｙｓｉｓをブロットしても検出はかなり厳しいと思います。Ｌｙｓｉｓを免沈してみては？ただし、Anti-Hisは特異性が低いと思うのでネガコンは忘れずに。あるいはＦＡＣＳで細胞内を見るのも手かと思います。ただし、これも取り込まれる量に大きく依存しますのできついかもしれません。

タンパクの取り込みを確認するには 削除/引用 No.405-1 - 2007/10/26 (金) 09:53:43 - O 細胞培養上清にリコンビナントタンパクを添加しているのですが、そのタンパクが細胞内に取り込まれているかどうかの確認をするにはどのような実験を行えばいいのでしょうか？添加タンパクが細胞膜表面のレセプターに結合しているのではなく、細胞内に取り込まれて機能しているかどうかを確認したいのですが、いい方法が分かりません。 ちなみに、リコンビナントにはHis-Tagがついていますが、lysateから抽出したタンパクをウェスタンしてHis-Tag抗体で見てもバンドは確認できず、しかし添加タンパクに対する抗体ではバンドが見られます。

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