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STZ誘発糖尿病モデルマウスの作成 削除/引用 No.404-29 - 2009/05/22 (金) 12:18:37 - 北村紀子 マウスなのですが私もSTZ誘発糖尿病モデルマウスを作成しています。 アドバイスするというわけでは、ないのですが、私の方法を乗せてみました。 何か、不都合な点がありましたら、逆に教えてくださるとありがたいです。 <条件> 動物： C57/Bl　およそ20g STZ： 200mg/kg i.p. (溶媒：0.05Mクエン酸緩衝液 pH4.5、　常温で投与） 実験： ストレプトゾトシン　マウスの体重に対して　200mg/kg ０day、4dayの血糖値を比較する。 <protcol> クエン酸緩衝液を作成する(１００ｍｌのビンに作成しています。)クエン酸480.5mgとクエン酸ナトリウム661.8mgをとり、(この割合だとPH=4.5となる)ように、混ぜI.E.Wを95ml加え混ぜとけるまで混ぜる。その後、オートクレーブをかけ、4度保存しておく。 ↓ あらかじめ、マウスの体重を測定しておき、0dayの血液を尾静脈採血を行い、40ul採取する。 ↓ ストレプトゾトシン(-20度保存)を１5mlファルコンにとり、クエン酸緩衝液に溶かさずに氷上においておき急いで動物舎へ ↓ 動物舎でクエン酸緩衝液(このとき、クエン酸緩衝液は、冷た過ぎるとマウスに投与するにあたって問題があると考え、常温にほどです。)とストレプトゾトシンを混ぜる (20mg/ml)。ストレプトゾトシンは、混ざりにくい。激しく混ぜたり、ボルテックスを用いずに転倒混和で、ゆっくり溶かす。 濃度はマウスに対してストレプトゾトシンを200mg/kgにするために、クエン酸に対してストレプトゾトシンを20mg/mlとし、このストレプトゾトシン溶液を0.1ml/gで投与しています。 ↓ マウスに腹腔内投与する。クエン酸緩衝液に溶かしてから、マウスに投与するまで10min以内です。(最大、連続5匹まで投与しました。1番はじめのマウスが血糖値が上がりやすく 、最後に投与したマウスが血糖値があがりやすいということは、ありませんでした。ランダムに時々血糖値が低いマウスがいます。) ↓ 4dayに、頚動脈採血を行い、血液を採取する。その後、氷上に3h〜4hほどおいておき、血液が固まったことを確認したのちに遠心(13000rpm、15min)で上清をとり、これを血清とし、血糖値を測定する。 時々、血糖値が上がらないときの問題点として、 ・ストレプトゾトシンがマウスに投与する前にストレプトゾトシンが分解してしまっている。 →混ぜ方に問題がある。 ・ストレプトゾトシン溶液が、正確な量をマウスに投与できていない。 →1mlの注射筒を使っています。たとえば20gのマウスだと0.2mlストレプトゾトシン溶液を投与することになるのですが、0.01ml(1メモリ分)ずれると5%ずれる計算になります。 などを考えました。 疑問がありましたら、連絡いただけるとうれしいです。 norikokitamura2011@yahoo.co.jp

あら？ 削除/引用 No.404-28 - 2007/11/02 (金) 18:45:56 - 通りすがり Kouji様 私は「きむ様」にコメントしたのに、「kouji様」から返事がきましたよ（笑） お二人は同一人物なのですか？？　企業の科学者らしからぬ振る舞いですね。 いずれにせよ、「きむ様」の先のコメントの「試薬や投与経路に関わらずに」という文言が引っかかったまでです。真意はわかりました。

e 削除/引用 No.404-27 - 2007/11/02 (金) 18:23:08 - 通りすがり

(無題) 削除/引用 No.404-26 - 2007/11/02 (金) 12:20:48 - kouji 通りすがり様 > しかし、ＳＴＺを４℃のバッファーで溶解するとピペッテイングでは意外と溶けにくく時間がかかりませんでしたか？（私の昔の記憶では・・） 4℃で溶かすからと溶けにくいと思います。 常温でやった方が溶けやすいと思います。 もちろんSTZの濃度が高いと溶けにくいですが。 （基本的な溶解度の問題ですね） > 「なんでもかんでも用時調製が常識」という姿勢は要領が悪くないですか？　試薬によっては、大量調製したものをストックして分割使用したほうが、その都度用時調製するより薬物濃度のバラツキも手間もコストも軽減される場合も多々あるかと思います。なんでもかんでも常識だと型にはめず、試薬の性質や実験プロトコールを考慮して、最適な調製方法を検討することが重要だと思います。 逆に言うと大量調製しようとするから失敗する場合があるのも事実です。（通りすがり様のご指摘の通り、最適な調製方法を検討するのは賛成ですが、なんでもかんでもストックしておけばいいいというわけにもいけません）。粉末状態で秤量・分注保存しておき、使う直前に溶かします。吸湿性のある薬物やbufferに溶かすと不安定な物質は大量調製してストックできません。確かに手間もコストもかかり面倒ですけれども、正確な実験をし、無駄な実験を減らすためには労力を惜しまないことです。特に動物実験は命を預かるので、3Rをしっかり守り、失敗して命を無駄にしないように心がけなければなりません。 私は企業の研究員ですが、失敗は決して許されない立場でプレッシャーがあります。週報・週計画・月間計画・月間報告などを元に非常に質の高い実験を要求されるので、先見の明を持って実験に挑まなければいけません。その点において、プロトコル作製は非常に重要です。実験が失敗すると、チームに影響を及ぼし、全ての計画が狂ってしまい、会社や共同研究先に多大な迷惑をかけてしまいます。アカデミックにいたときは失敗しても何度もやり直しもできたし、ゆるい感じで実験できたので、今考えると羨ましい環境にいたのだと切に感じます。 皆様、実験頑張ってくださいね。

ボルテックス 削除/引用 No.404-25 - 2007/11/02 (金) 09:59:47 - 通りすがり きむ様 そんなに違うものなのですね。私もこれまでボルテックスとピペッティングの差まで考慮せずに、ボルテックスしてました。その他の研究者の皆様もピペッティングなのですか？ しかし、ＳＴＺを４℃のバッファーで溶解するとピペッテイングでは意外と溶けにくく時間がかかりませんでしたか？（私の昔の記憶では・・） いずれにしても、STZは不安定という見解が多数なのですね。 ＞でも投与する直前に溶かしますけどね。 （試薬や投与経路に関わらずに。これって常識でしょ？ 「なんでもかんでも用時調製が常識」という姿勢は要領が悪くないですか？　試薬によっては、大量調製したものをストックして分割使用したほうが、その都度用時調製するより薬物濃度のバラツキも手間もコストも軽減される場合も多々あるかと思います。なんでもかんでも常識だと型にはめず、試薬の性質や実験プロトコールを考慮して、最適な調製方法を検討することが重要だと思います。 kouji様 ＞2群2例では統計的有意差は出ないと思います。 vehicleを含めてせめて3群N=6は欲しいところです。 「検証」するならそうですね（でも動物18匹も使うのには若干抵抗が。。）。あきやま様がおっしゃるように「傾向をつかむ」なら２、３匹でも差が現れそう。

(無題) 削除/引用 No.404-24 - 2007/11/01 (木) 23:54:19 - kouji 2群2例では統計的有意差は出ないと思います。 vehicleを含めてせめて3群N=6は欲しいところです。

(無題) 削除/引用 No.404-23 - 2007/11/01 (木) 23:50:27 - きむ STZはラジカルに対して不安定なので、ボルテックスするとそこから急速に分解するのではないでしょうか？ 試薬をなんでもボルテックスして調製するのはナンセンスです。 私はピペッティングで溶かして問題なく実験できています。 でも投与する直前に溶かしますけどね。 （試薬や投与経路に関わらずに。これって常識でしょ？時間が経ったものを使うなんて気持が悪いです）

科学的エビデンスがない？ 削除/引用 No.404-22 - 2007/10/31 (水) 18:31:46 - あきやま ＳＴＺが不安定ということに科学的にエビデンスがないのであれば、実際に検証してはいかがでしょうか。むやみな動物実験は倫理的にも相応しくはありませんが、「都市伝説」と明言された文責もありますし。 例えばこんな検証でいかがでしょう。 ラット♂（10週齢前後、リタイア動物は不可）にSTZ(25mg/kg i.v.)を単回投与し、24時間後の�剏兼恍lを判断基準とする。 群１：STZに溶媒（4℃）を加えてから、ちょうど1分後（ボルテックス所要時間含む）に急速静注する。（STZは一匹分ごと調製） 群２：群１で調製したSTZの残液を室温で60分間放置したのち、急速静注する。 低用量のSTZなので、STZの安定性が血糖値に反映されやすいかと思います。静脈内投与に自信があれば２例ずつでも傾向がつかめるのでは。

ＳＴＺの不安定性 削除/引用 No.404-21 - 2007/10/31 (水) 18:01:34 - 通りすがり 私も、しま様の意見に賛成です。 「ＳＴＺは溶解直後に動物に投与した方が糖尿病発症率は高い」と肌で実感している一人です。特に低用量のSTZを使用する実験では重要と思います。 それと「STZの溶媒にはクエン酸緩衝液を使用せよ」のほうが、都市伝説ではないでしょうか。 単純に生理食塩液で調製している文献は数多くあります。

(無題) 削除/引用 No.404-20 - 2007/10/29 (月) 15:44:36 - しま STZが不安定なのは都市伝説だと切り捨てられてしまいましたが（笑） 静注に慣れていない人が30匹のラットににSTZを投与したら、 最後の方は血糖値が上がらなかったりしたことがあったので、 ウチでは調製後、使用するまでの時間を申し送りしています。 またあるラボでは、マウスの実験で、実験室で調製したSTZを 投与していたときの糖尿病発症率が70%だったのに対し、 動物室で調製するようにしただけで90%以上になったそうです。 初めて実験をされる方なら、たいした手間ではないので 気をつけられたらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.404-19 - 2007/10/29 (月) 08:53:08 - RS STZ様 エチレンラウリルエーテルについてのご説明ありがとうございます。 しっかり組成に注意しようと思います。 ks様 そうですね、あまりSTZについて知識が不足しているかもしれません。 あくまでも今行っている実験はpre実験であるので、動物も本来なら別の実験系でdrop outした個体を再利用しているので、特にコストパフォーマンスが悪いとは思っていません。 また、基本的には別の実験系を主実験にしており、時間の余裕を見てSTZの実験系を行っているので、pre実験の段階であまり時間を割かないようにしています。 でも、citrate bufferは自分の手で作製した方が良いかもしれませんね。 他のパラメータについてですが、過去に仲間が同じ実験系で体重などのパラメータを見ています。 私はだいたいの体の大きさやケージの異常性を見てはいます。 また、血糖値のcriteriaが250 mg/dlといわれているようで、何度か腹腔内投与では微妙に届かなかったと言っていたので、静注をしています。 皆様、貴重な意見どうもありがとうございます。

クエン酸緩衝液 削除/引用 No.404-18 - 2007/10/28 (日) 03:55:06 - STZ クエン酸溶液を、水酸化ナトリウムでpHをあわせて、最終濃度のクエン酸濃度になる様に水でメスアップして作ったものと、最終濃度のクエン酸溶液、最終濃度のクエン酸ナトリウム溶液を混合して、pHをあわせて作ったものには何ら代わりがありません。（ただし、イオンへの解離が極度にその濃度に影響する場合、pHをあわせる前の溶液は、最終ボリュームに近いところで作成し、pHをあわせるのが望ましい）。ただし、最終濃度のクエン酸ナトリウム溶液に適当量のクエン酸や塩酸を入れてpHをあわせて作る事は出来ません。クエン酸の最終濃度が変わる、あるいは対となる塩や酸の種類が変わるからです。

(無題) 削除/引用 No.404-17 - 2007/10/28 (日) 00:39:40 - ks STZ誘発糖尿病モデルラット作製に関して。 STZの系は私も実験しました。 モデルラット作製において、少なくても最初の投与から8〜12wksまで病態を持続させ、実験するべきです。 （論文投稿の際にレフェリーのチェックが入ったことがあります） RSさんの系において糖尿病状態における体重の増減や他のパラメーターを見ていますか？ 血糖値だけをモニターしているように見受けられますが、急性毒性ではなく、糖尿病の慢性病態を見ているというエビデンスを提示できる環境を作る必要があります。 STZが不安定であることをよく耳にしますが、私に言わせれば科学的エビデンスのない都市伝説にすぎません。 たしかにラジカルの影響を受け分解しますが、30分以内に使わなければいけない、投与する直前まで冷やすとか、そこまで慎重に取り扱わなければならない物質ではありません。 不確かな情報に沸き過ぎです。

(無題) 削除/引用 No.404-16 - 2007/10/28 (日) 00:17:50 - ks >404-15 Why please try thinking whether it has the necessity to use citrate. Is in order to control hemolysis and solidification. And, being to be spelling mistake, English which is not accustomed should not be used. See you.

(無題) 削除/引用 No.404-15 - 2007/10/27 (土) 23:25:10 - yt >citrate bufferの作り方ですが、NaOHでpHを合わせたらだめです。 >溶血する原因になります。 How does this happen? Ploease explain the mechanism. I guess toxicity of polyoxyethylenelaurylether might be the likely cause of the death.

(無題) 削除/引用 No.404-14 - 2007/10/27 (土) 22:12:14 - ks citrate bufferの作り方ですが、NaOHでpHを合わせたらだめです。 溶血する原因になります。 クエン酸三ナトリウムニ水和物とクエン酸でpHコントロール、1mM〜5mMにしてフィルター滅菌しなさい。

(無題) 削除/引用 No.404-13 - 2007/10/27 (土) 22:03:16 - ks これまでBioTechnicalフォーラムに投稿された一連のRSさんのトピックを拝見致しましたが、あまりにも考え方が幼くまたご自身の研究対象のバックグラウンドに関して無知すぎます。 かなりの実験動物を無駄にしているように見受けます。 プロトコル作製の時点でよく実験系を検討していますか？ 動物実験を行う研究者としての資質に関わると思います。 citrate bufferの件は非常に驚きました。 それとコストパフォーマンスの意味を履き違えています。 citrate bufferぐらい最初から自分で作りなさい。 簡単じゃないですか。 無駄な動物実験をしてしまったことが一番のコストですよ。

緩衝液 削除/引用 No.404-12 - 2007/10/27 (土) 01:14:14 - STZ ポリオキシエチレンラウリルエ-テル は界面活性剤、平たくいうと洗剤です。アミノ酸分析器はカラムを分析に使うので、カラム圧の上昇を防ぐために入っています。 クエン酸のみで水酸化ナトリウムでpHをあわせて作成しています。

(無題) 削除/引用 No.404-11 - 2007/10/26 (金) 19:18:32 - RS しま様 ご指摘ありがとうございます。 確かにSTZは分解しやすいということが前のトピックでも議論されていました。 もしかしたら、分解したのかもしれませんが、クエン酸だと比較的時間が経って(30分)投与してもさほど血糖値には影響がない印象を持っています。 クエン酸バッファーの組成など調べてみます。 いくつか試してみようとも思います。

すみません、誤爆しました… 削除/引用 No.404-10 - 2007/10/26 (金) 18:55:31 - しま 気を取り直していきます。 STZが失活して血糖値が上がらなかったということはないですか？ 溶解しているかどうかは目視で確認できますが、 溶解した後、時間が経つとSTZは失活してしまいます。 わたしは15分以内に投与するようにしています。 クエン酸バッファーの作り方はすぐに調べられるので、 わたしが説明するまでもないと思いますが、 それぞれの試薬を求めるモル濃度に調製したものを混合して、 pH4.5に合わせるだけです。混合比はご自分で確認してください。 また、投与液なので一応0.22μのフィルターを通します。 基本的な手法はリン酸バッファーの調製と同じですよ。

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