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3つ以上の抗生物質 削除/引用 No.399-9 - 2007/10/31 (水) 04:34:19 - 抗生物質 便乗質問ですが、3つ以上のプラスミドを細胞にトランスフェクションして、3種類以上の抗生物質で選択をする、といった実験をされた方はおられますか？ 当方、「二種類の遺伝子をそれぞれ薬剤でinducibleに発現することが出来るCell line」を作りたいと思っています。inducible expression システムの多くは2つのプラスミドをトランスフェクトする形のものがほとんどなので、理屈の上では4つのベクターを細胞にトランスフェクトしなくてはなりません。さすがに難しいかなと思っているのですが、もしもどなたか経験のある方がおられましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.399-8 - 2007/10/29 (月) 18:22:31 - ~ G418,ブラストサイジンS G418,ハイグロマイシン でやったことがあります。 もし、蛍光が邪魔にならないのならば、 HygroEGFPは蛍光と薬剤耐性の両方が一度に使えるので便利でした。

(無題) 削除/引用 No.399-7 - 2007/10/29 (月) 10:58:25 - a G418, Zeocinのダブルセレクションは行ったことあります。 確かベクターはpSecTag2(Invitrogen)とpEGFP**(レポーター用に改良したもの）。ZeocinはInvivogenのを使用した記憶があります。濃度は用いる細胞で検討された方が良いです。G418よりシャープに効く印象がありますので、徐々に濃度を上げていった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.399-6 - 2007/10/27 (土) 23:52:06 - えーっと もうひとつ質問があります。 市販されているプラスミドの中で、今回の目的に合うもので安いものをご存じないでしょうか？ 最悪、抗生物質耐性遺伝子のみ発現するものでもいいです（目的の遺伝子は別のベクターでコトランスフェクションします）。

感謝 削除/引用 No.399-5 - 2007/10/27 (土) 18:55:49 - えーっと おおさん アドバイスありがとうございます。どれでもいいというのを聞いて安心しました。 atsさん 経験談も踏まえて貴重な情報ありがとうございます。経験談が聞けるというのはなかなか無いので、今回の情報は非常にためになります。 書き忘れていましたが、今回の細胞では、以前puromycinを持つプラスミドだけをトランスフェクションし、セレクションをかけたのですがまったく耐性株が得られませんでした。つまり、濃度を振ってpuromycinをかけたのですが、低濃度だと親株もトランスフェクションした株も死なない、高濃度だと親株もトランスフェクションした株も同じ割合で死ぬ、といった現象があり、puromycin自体は使えないと考え、neomycinで安定発現株を得ました。 ですので、今回の場合はpuromycin以外で、どれか利くものを選択する必要がありそうです。今候補に挙がっているのがZeocinなのですが、Zeocinでうまくいった方おられますでしょうか？ ＞＞さらに、導入する遺伝子の機能にもよりますが、安定発現細胞の性質が親株と大きく変わることが「たまに」あるので注意してください。この意味は、導入細胞の表現型が、親株＋導入遺伝子の機能＋＠になるということです。導入細胞の選択方法（極端に細胞密度が低い状態で培養するなど）によっては「（もともと集団に存在していた）アポトーシスに耐性に強い」細胞を優先的に選択してしまった可能性もあります。導入した遺伝子（構成：エンハンサーなど）の導入部位による効果もあるでしょう。 非常に貴重な情報ありがとうございます。前回の安定発現株の作成では、５クローン中２クローンで安定発現が見られ、２クローンとも予想通りの結果が得られているので、特異的な効果のように思っています。が、観察していない点ではもしかすると＋＠の効果がでているかもしれませんね。奥が深いですね。

(無題) 削除/引用 No.399-4 - 2007/10/27 (土) 14:39:18 - ats 動物細胞の選択マーカーとしては、非導入細胞がすぐに死ぬほうが選択が楽です。 そのため、私の選択は以下の順になり、対応ベクターがない場合は自作しています。 （一回作れば研究室で使い回しできるので....。） (1)puromycin (0.5〜2ug/mL, 通常1ug/mL)、死滅するまで2-3日 (2)blastcidin S(5〜20ug/mL, 通常10ug/mL)、死滅するまで3-4日 (3)hygromycin (100〜500ug/mL, 200-250ug/mLの細胞が多い)、死滅するまで3-6日 できるだけ避けたい（と思っている）のがG418とZeocinです。 Zeocinに関してA431細胞にはmanual最高濃度でも効かなかったので、お使いの細胞で事前に試すことをお薦めします。よく効けば選択肢に入ると思います。 FACSソーターが使えるならGFPも選択肢になります。 私は目的タンパク発現細胞を確実に選択するため、IRESも多用しています。 また、クローニング効果を避けるため、最近はレンチウィルスベクターを用いて50クローン以上の集団（バルク）でアッセイするようにしています。 これらは、経験的に手間が比較的かからず短期間で（安定した）結果が得られるので採用しています。 参考までに（学生のときに）安定発現細胞の作製で経験したことは... -複数クローンを単離して（苦労して時間をかけて）増やして調べたら発現していなかった。 -発現したクローンが得られたら、親株と形態が変わっていた。 -なぜか、薬剤耐性度が落ちてきて死滅した、等々。 上記のことは、手技が悪かっただけかもしれません。 さらに、導入する遺伝子の機能にもよりますが、安定発現細胞の性質が親株と大きく変わることが「たまに」あるので注意してください。この意味は、導入細胞の表現型が、親株＋導入遺伝子の機能＋＠になるということです。導入細胞の選択方法（極端に細胞密度が低い状態で培養するなど）によっては「（もともと集団に存在していた）アポトーシスに耐性に強い」細胞を優先的に選択してしまった可能性もあります。導入した遺伝子（構成：エンハンサーなど）の導入部位による効果もあるでしょう。 この場合は、親株の内在遺伝子の機能をsiRNAなどで減弱させて導入効果と逆の結果が得られれば良いでしょう。 思い出しましたが、G418耐性を与えるneo-R遺伝子は導入細胞の脂質組成に影響するという論文を見たことがあります。 以上、気がついたことを書きましたが、遺伝子導入細胞は一過性発現系にはない長所も多く、優れた結果が得られますので、実験をがんばってください

(無題) 削除/引用 No.399-2 - 2007/10/26 (金) 01:21:25 - おお ぶっちゃけ、何でもいいかなと言うのが個人的な感覚です。どうしてもという時はクロンテックのテットon/offシステムとかはテットのシステムのプラスミドとテットで制御されるプロモーター2つ入れないと行けないので(昔のやつだとおもう)2つプラスミド(こうせい物質)を使っていますし、そういうシステムはちらちら見受けますので１度みて、参考にされればいいと思いますがいかがでしょうか。 ハイグロマイシンは個人的には好きですが、、、、

抗生物質マーカー 削除/引用 No.399-1 - 2007/10/26 (金) 00:02:18 - えーっと 現在、ある遺伝子Aを発現させた安定発現株を持っています。この株の作成のためにネオマイシンを選択マーカーとして使いました。 今回の実験では、この安定発現株にさらに遺伝子Bを安定発現させたいと考えています。そのための選択マーカーとしてどの抗生物質を選ぶか考えています。 何かいい組み合わせというのはあるのでしょうか？また、同じような経験をお持ちの方おられますでしょうか？何かアドバイスをいただければ幸いです。

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