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HAtag付きタンパクと界面活性剤 トピック削除
No.390-TOPIC - 2007/10/25 (木) 11:56:51 - yuki
現在精製を行っているのですが、うまく目的のタンパクが精製されません。
細胞に強制発現させたタンパクなので発現は一発でわかるほどの発現量です。
しかし、RIPA Bufferにて細胞を溶解させ精製をHA抗体により行うと、
ほぼ全ての目的タンパクが精製されていません。
(精製はCatch and releaseというキットを使用して精製してます。
条件は室温で1時間や、4℃で一晩など色々試してみました)
これはRIPA bufferに入っているSDS(終濃度0.1%)、NP-40(終濃度1%)などの海面活性剤の影響なのでしょうか？
　
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3F10 削除/引用
No.390-4 - 2007/10/25 (木) 14:21:26 - みつる
ロシュの3F10クローンがHA抗体としては良いです。
catch and release　kitは経験ないので分かりませんが、proteinG-sepharoseなどお持ちなら普通にIPしてみては？

あと、基本事項ですが、westernのinputとしてtotal lysateを流されてるのでしょうか？
抽出されているか否かはそれで確認できるでしょうから（勿論、トランスフェクトされているか否かも）。

(無題) 削除/引用
No.390-3 - 2007/10/25 (木) 12:40:05 - めんちん
別のHAタグが付いたタンパク質が今の実験条件で回収されてくるなら、その精製しようとしているタンパク質に対する実験条件が適切でないと思われます。

たとえば、タグの位置が悪く、タンパク表面に出ていない。とか、細胞溶解後、遠心した上清を精製に使っているのなら、沈殿画分にタンパクが行っているとか。

(無題) 削除/引用
No.390-2 - 2007/10/25 (木) 12:18:09 - HA
HA抗体の12CA5はdeoxycholate存在下で抗原との結合が落ちると聞いたことがあります。

HAtag付きタンパクと界面活性剤 削除/引用
No.390-1 - 2007/10/25 (木) 11:56:51 - yuki
現在精製を行っているのですが、うまく目的のタンパクが精製されません。
細胞に強制発現させたタンパクなので発現は一発でわかるほどの発現量です。
しかし、RIPA Bufferにて細胞を溶解させ精製をHA抗体により行うと、
ほぼ全ての目的タンパクが精製されていません。
(精製はCatch and releaseというキットを使用して精製してます。
条件は室温で1時間や、4℃で一晩など色々試してみました)
これはRIPA bufferに入っているSDS(終濃度0.1%)、NP-40(終濃度1%)などの海面活性剤の影響なのでしょうか？
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