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EDTA溶液の調整方法 トピック削除
No.379-TOPIC - 2007/10/24 (水) 04:46:50 - Y
RNA labeling reactionの際、反応停止の為に、0.2M EDTA溶液を添加すると書いてありますが、この溶液はどのように作成するのでしょうか？pHの表記は特にないので、分量をミリQ水に溶かし、オートクレーブしたらRNase free溶液として使えるでしょうか？
　
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No.379-8 - 2007/10/24 (水) 16:32:22 - hon
ノーザンのように大量に水が必要でなければ、
DNase/RNase freeの水（試薬）を買ってしまうのが早いと思います。


まー。ノーザンもそんなに気にしなくても大丈夫ですが。
以前いた研究室では普通のミリＱ水を３時間オートクレーブし、
ガラス試薬は感熱滅菌を２時間くらいかけて、
プラスチック（タッパー等）はRNase不活剤かＨ２Ｏ２で処理してノーザンやRT-PCRを行っていました。これも今思えば、おまじない程度でしたが、これで問題が出たことはありませんでした。

あと、ＥＤＴＡ溶液なら分子生物学グレードで購入できたと思います。
それならDNase/RNase freeです。

(無題) 削除/引用
No.379-7 - 2007/10/24 (水) 16:12:54 - ごそまる
専門家ではないですが、私の先生が言うところにはRNaseは非常に頑丈でオートクレーブやプロテアーゼ処理では活性を失わないことがあるそうです。
先生のいうところでは、RNaseのコンタミで半年は実験がまともにできなかった研究室もあるそうです。
RNaseは試薬由来以外でも手指などにも付着していますので非常に注意しなければいけません。僕がいた部屋ではDEPC処理したものをオートクレーブにかけてから使用していましたが、PDさんのおっしゃられるように購入してしまうのも手かと思います。

市販品 削除/引用
No.379-6 - 2007/10/24 (水) 12:42:51 - PD
調整の仕方ではありませんが、器具を洗ったりするのが結構面倒ですから、市販品を買うのも手かと思います。インビトロジェン等で、確か４ー５００ｍｌで５，６千円だったと思います。
４００ｍｌもあれば数年は持つかと。

ちなみにRNA labeling reactionはキットでやる人が多いと思いますが、キットの中にTermination mixとかEDTA溶液が入っていませんでしたか？

(無題) 削除/引用
No.379-5 - 2007/10/24 (水) 11:46:42 - AP
補足です


>分量をミリQ水に溶かし、オートクレーブしたらRNase-free溶液として使えるでしょうか？

試薬自体は、よほどひどいグレードでなければ、特にRNase-freeを称してなくても大丈夫でしょう。
しかしmilli QはRNase freeを保証していません。メンテナンスとか仕様様式によって大丈夫かもしれないし、だめかもしれない（RNase-freeを保証する水をくみ出し口用アタッチメントは売られていますけれど）。RNase-free水を買うかDEPC処理水を使った方が安心かもしれません。

あとは器具ですが、研究室の環境によってはビーカーやpHメータのプローブなど、RNase除去の処理が必要でしょう。

ちなみにEDTA溶液はDEPC処理ができるので（DEPCの標的は第一アミンなので、第三アミンであるEDTAとは反応しない）、調製が終わってオートクレーブをかける前にDEPC処理するというのがもっとも簡単かも。

(無題) 削除/引用
No.379-4 - 2007/10/24 (水) 11:28:12 - AP
EDTAは電離度の低い酸ですので、ただ水に入れてもほとんど未電離で溶けません。
溶かすには塩基を加えてpHをあげてやる必要があります。

ふつうはNaOHを加えながら溶かしpH 8.0にします（逆にpH 8くらいにならないと溶けない）。

NaOH水溶液を使うとかなり大量に必要になるので、はじめのうちは固形のNaOHを入れて、終点近くなったら10 N NaOHであわせるといいでしょう。
EDTA・2Naだとおおよそ10 gの粉末に対して固形のNaOHが少なくとも1 gは必要です。

(無題) 削除/引用
No.379-2 - 2007/10/24 (水) 08:49:25 - おお
EDTAは酸性では解けにくいので溶かす時にpH8に合わせるのが一般的です。RNaseについては、RNaseフリーのグレードの試薬を使ってミリQから直接取った清潔なやつを使うのがいいと思います。さらにタンパク高吸着の0.2ミクロンのフィルターで濾過するとタンパク(RNase)のコンタミが防げます。オートクレーブはあまり効果がない時があります。

EDTA溶液の調整方法 削除/引用
No.379-1 - 2007/10/24 (水) 04:46:50 - Y
RNA labeling reactionの際、反応停止の為に、0.2M EDTA溶液を添加すると書いてありますが、この溶液はどのように作成するのでしょうか？pHの表記は特にないので、分量をミリQ水に溶かし、オートクレーブしたらRNase free溶液として使えるでしょうか？
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