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(無題) 削除/引用 No.374-8 - 2007/10/23 (火) 23:29:43 - MNMN 自分は同じゲルで2枚のメンブレンに転写したことがあります。 PVDF膜に転写すると　たいていは一度目できれいに写ってしますのですが 蛋白によってはゲルへの残存がありました。 ニトロを用いた場合でも、転写後のゲルを染色すると やはり蛋白質が残っていました。 転写バッファーをいくつか試してみても どうしても残ってしまいあきらめました。 同じサンプルを泳動して、蛋白の残り具合を比較するのに 一回目、二回目、三回目の転写後のゲルをそれぞれ染め比べた時に 小さい分子量や転写されやすい蛋白質はやはり 転写を繰り返していくとゲル中から抜けていました。 他の方々がおっしゃるように、本来は転写されるべきだとは思いますが、 WBに用いてみてニトロでは二枚目でも検出できたので　 傾向をみるなどには使えるかと思います。 また、転写後のゲルを使って、残っていた蛋白質を MSの同定に利用したりもしました。 扱う蛋白質によってはゲルから出づらいのかなと思い 詳しく勉強していないので　経験談でしかなく申し訳ありませんが 参考になりましたら幸いです。 頑張ってください。

失礼しました。 削除/引用 No.374-7 - 2007/10/23 (火) 21:16:29 - mom 自分の知識が最新ではないということに注意を払うのを忘れていました。失礼をお詫びします。 ところで、Tさんのご紹介くださったキットですが、Tさんは実際にお使いになっていらっしゃるのですか？お使いになっている方、使い勝手などはいかがでしょう？ あたりまえですが、遠い位置のメンブランほどバンドが段階的に薄くなるわけですが、この「薄くなっていく程度」というのはタンパクのサイズや種類によって異なるように思うのですが、どんなものでしょう？あるいは、もともと濃いときともともと薄いときで異なるというようなことはないのでしょうか？例えば、濃いバンドは10枚までブロッティングされるが薄いものは3枚あたりで消えてしまう可能性もありますよね。薄いバンドがギリギリみえる3枚目でも、薄いバンドもはっきり見える1枚目でも、濃いバンドは飽和状態であまり濃さが変わらないこともありえるのではないかと。 個人的には定量性は1枚ずつブロッティングする場合よりも劣るような気がしますが、お使いになっている方の感じではいかがでしょう？どうせウエスタンで正確な定量ができているわけではない、という考え方もあると思いますが…。限界をよく考えた上で、スクリーニングなど多量のサンプルを一度に処理したい時には便利、という感じなのでしょうか？ お使いになっている方、なにかご意見がありましたらお願いします。（多分、トピ主さんの意図からは外れていない質問だと思うのですが。）

(無題) 削除/引用 No.374-6 - 2007/10/23 (火) 20:20:07 - Ｔ これですね。 http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/pdf/MRBKit-ULTRA.pdf

(無題) 削除/引用 No.374-5 - 2007/10/23 (火) 19:29:04 - あ 一枚のゲルに数枚のメンブレンを重ねて転写するキットのようなものが あったと思います。 フナコシかコスモバイオのパンフレットで見たと思いますが。 業者さんにきいてみたらわかるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.374-4 - 2007/10/23 (火) 19:10:31 - ウエスたん それは質問が逆ですね。適切な条件で転写をすればゲルにはタンパク質はほとんど残りません、と言うか、そういう条件で転写をすべきです。もしもタンパク質が沢山残っているなら、もう一度転写することもできると思いますが、その場合には、一回目も二回目もウエスタンのシグナル強度とタンパク質量の関係はアテにできなくなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.374-3 - 2007/10/23 (火) 18:58:53 - 急いでます。 解釈はあっております。リプロービングなどやっているのですが、一枚のゲルから数枚のメンブレンに転写できたらなとあさはかな考えがうかんだもので・・・ というのも、ゲルを転写してからCBB染色してみるとバンドが見えるのでもしかしたらと思い書き込んでみました。 通常はゲル中のタンパクはメンブレンに全部転写されるものなんですか？ 基本ですみません。

無理。 削除/引用 No.374-2 - 2007/10/23 (火) 14:37:57 - mom 日本語を読み間違っているといけないのですが、おっしゃることは「1枚のゲルから2枚（あるいはそれ以上）のメンブランに転写したい」ということでしょうか？ メンブランに転写したらゲルにはタンパクは残りません。残っていたらきちんと転写できていないということです。 1枚のメンブランに対して複数の抗体を使うなら、リプロービングするとか、メンブランを切り分けるとか、状況に応じた方法があると思います。 お急ぎなのはわかりますが、きちんと実験の原理等理解されてから実験を始められた方が、最終的には早道かと思います。

western blotting手法 削除/引用 No.374-1 - 2007/10/23 (火) 14:21:40 - 急いでます。 western blotting初心者なのですが早急にデータを集めないといけなくて困っております。ゲルからメンブレンにタンパクをセミドライ式で転写させているのですが、早急にデータを集めたいので、ゲルからメンブレンにタンパクを転写させるのをもう一度一回転写させたゲルを用いて違うメンブレンに転写できたらなと思ったのですが、このようなことは可能ですか？やられた方がいましたら教えてください！！ あさはかな質問ですみません。

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