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(無題) 削除/引用 No.371-6 - 2007/10/25 (木) 18:41:36 - RNA そばさん，皆様，ありがとうございました． 希釈溶液にはDEPC水を使っておりました． QIAGENのシートも確認しました． 測定値に再現性無かったので，光度計の故障かとも思い 複数台試してみたりしていましたので，ホント助かりました． 説明不足には以後気をつけます． ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.371-5 - 2007/10/25 (木) 17:03:36 - そば ん〜？　何かが微妙に違う気がする・・・ TRIZOLを用いてRNA精製をした場合、最後にイソプロ沈をして、70%エタでリンスを行いますよね。その後ペレットをRNase free waterに溶解します。このペレットの溶解の際にはTEや0.5%SDSなどが推奨されることもありますが、このペレットを溶解する液のことではありません。 さらにこの後、溶解したRNA溶液の吸光度を計測すると思いますが、RNA溶液を全部使うわけにはいきませんから、RNA溶液の一部を取り、それを”希釈して”吸光度を測定し、元の溶液の濃度を計算して決定すると思います。 この”吸光度を測定する際にRNAを希釈する液”に水やDEPC水を用いてませんか？という意味です。 もし、この液に水を使っているのであればratioは2.0にはならず、ずっと低い値になってしまうはずです。一応、QIAGENの取り扱い説明書とかにも書いてあるのですが、TRIZOLには何も注意書きが無いみたいですね・・・。 (吸光度のratioはpHの影響を受けるので中性域のバッファーを使用してください、という注意書きがあります） ちなみに私は10mM Tris/HCl pH8.0を使っていますが、これを使うとratioは約2.0に、水で行うと1.5前後になります。

(無題) 削除/引用 No.371-4 - 2007/10/25 (木) 15:47:54 - RNA 説明不足ですみませんでした． 純度が悪いというのは，OD値が低い（1.2〜1.4）ということです． まだ電気泳動などはしておりません． 希釈溶液にはDEPC水（すでに水のみで販売されているもの）を使用しています．TEやSDSを使用したほうがよいとの書き込みも拝見したのですが，そばさんがおっしゃりたいことは，このことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.371-3 - 2007/10/25 (木) 12:28:13 - PD1 前の方と重なりますが、たとえばODの低い、回収率が悪い、分解している等、純度が悪い、という点がわからないとコメントのしようがありません。 一般的に、ということで書くと 1),2)は、処理に時間がかかることが不安でしたら、組織を回収後すぐ液体窒素につけて一度凍らせてしまえばよいです。凍った組織をRNAlaterにつけて、少し溶けてきたところで破砕してますが問題ありません。。 5)は適当（おおよそで）で大丈夫です。確かに、骨格筋は他の柔らかい臓器（脳とか肝臓とか）に比べてRNAは取りにくいと思ってますが、RT-PCRに使う分には問題なくとれています。

(無題) 削除/引用 No.371-2 - 2007/10/25 (木) 11:23:38 - そば 質問に質問で返して申し訳ないですが、「RNAの純度が悪い」と考えた原因は何でしょうか？ 「吸光度の260nm/280nmの値が2.0ぐらいにならないから精製後のRNA純度が悪い」というトラブルを訴える方の多くに、吸光度測定の際に水を希釈液として使用するというミスが多く見受けられるのですが、心当たりは無いですか？

骨格筋からのRNA抽出について 削除/引用 No.371-1 - 2007/10/23 (火) 02:58:28 - RNA こんばんは． RNA抽出を始めたばかりで，純度の高いRNAが抽出できず， 考えられる原因について，いくつかご質問があります． 1)ラットを断頭してから組織を摘出してRNAlaterに漬けるまで5〜6分程度かかっています． その際，RNAは変性してしまうものなのでしょうか． 断頭はしないほうがよいのでしょうか？ 2)組織をRNAlaterに浸漬し，TRIZOLに移し替えてホモジナイズしております．その際，サンプルが10コ以上で，最初のサンプルから最後のサンプルまで30分程度のタイムラグがあります．とくに最初と最後のサンプルで差はなかったのですが，ホモジナイズの時間がRNA抽出に関係しているのでしょうか？（純度が低い場合にはホモジナイズ後すぐにクロロホルムを入れてくださいと説明書には書いてあったので）もし主な原因がそうであれば小分けして処理をしますが，皆様はおおよそいくつのサンプルを同時に処理し，その際の工夫などありましたらご教授ください． 5)RNAlaterでは組織を5mm角に切って，５倍の溶液量で浸漬してくださいとありますが， 組織の大きさや溶液量は正確に行う必要はありますか？　 今のところ原因について考えられるのはこのくらいです． 試薬等にコンタミはないと思います． TRIZOLの処理も２回行い，DNase I の処理もしました． もし，その他に考えられる原因などございましたら，お願いいたします．

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