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溶出されました。 削除/引用 No.37-6 - 2007/08/24 (金) 11:02:17 - EB normal mouse IgGをカップリングさせたビーズには 目的タンパクは結合していませんでした。 今回、カオトロピックでの溶出はうまく行きませんでしたが、(TBSで溶けました。)0.1 M glycine-HCl, 1% NP-40, pH 2.0という条件で試したところ 満足いくだけのタンパク量を溶出することができました。 ビーズの再利用も可能でした。 アドバイスくださった皆様ありがとうございました。

情報ありがとうございます 削除/引用 No.37-5 - 2007/08/10 (金) 19:23:18 - EB >Kさま PBSでは沈殿が生じてしまいますか。 TBSで溶けることを祈ってつくってみます。 >仕事中さま 抗原を流す前に0.2 M glycineバッファーで室温2時間ブロッキングを 行なったのですが、不十分ということもあるのでしょうか? ネガコンとしてmouse IgGをカップリングさせたビーズ をつくっていたのですがまだ確認していませんでした。 結果を見たらまたお知らせします。 >名無しさま 抗原を流した後のカラム洗浄には可溶化バッファーを 用いて洗浄しています。 また、溶出バッファーに可溶化バッファーと同濃度の界面活性剤 を加えて溶出も試みましたが、少し収量は上がったもののまだまだ 溶出されきっていないようでした。 私が用いている可溶化バッファーの組成は以下の通りです。 10 mM Tris-HCl, pH7.4 150 mM NaCl 0.5 mM EDTA 1% NP-40

(無題) 削除/引用 No.37-4 - 2007/08/09 (木) 11:07:29 - 名無し 可溶化に使ったバッハとカラムの洗浄や溶出に使ったバッハの組成が違うとそういう事起きるときあるというか前に一度あった。たぶん界面活性剤とかの組成が変わってカラム内で不溶化したのではないかと思う。可溶化から溶出まで界面活性剤の有無とか塩濃度を同じに保ってやったらちゃんと溶出された。（溶出のときはpHは変えたけど）

ここまで結合が強いと 削除/引用 No.37-3 - 2007/08/08 (水) 21:13:46 - 仕事中 抗体抗原反応というよりもビーズそのものと目的蛋白質の結合が起きてしまっているのではないでしょうか。 抗体を結合していないビーズに脳膜画分を流して確認されていらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.37-2 - 2007/08/07 (火) 11:42:27 - K NHSの販売元のGEに詳しいことが記載されています。 http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/faq/chm/aff_cap.asp#ac 参考になれば幸いです。 >この場合は溶媒に水ではなくPBSなどを用いればよいのでしょうか? ある条件で Mg は Phosphate と不溶性の沈殿を生じるので、Tris(例えば、TBS)などがよろしいかと存じます。 4M もの MgCl2 が溶けるかどうかはわかりませんが、以下のように調製するといいのではないでしょうか？ 5xTBS 200 ml MgCl2 813.2 g (!!) H2O 600 ml -------------------------------------------------- mess up to 1000 ml

アフィニティカラム溶出液の調整法 削除/引用 No.37-1 - 2007/08/06 (月) 21:32:20 - EB 抗体をNHSビーズにカップリングさせ、可溶化した脳膜画分を流して 蛋白を結合させたのですが、ほとんど溶出されません。 ビーズに直接SDSサンプルバッファーを加えると目的蛋白は 十分量結合していました。 溶出には0.1 M glycine-HCl, pH2.5と0.1 M triethanolamine, pH11.5 を用いましたが、ほとんど溶出されませんでした。 そこで、4 M MgCl2を試そうと思い、水に溶かすとpHが酸性だったので中性に調整しようとしたのですが、沈殿が生じてしまいました。 この場合は溶媒に水ではなくPBSなどを用いればよいのでしょうか? 正確な調製法をご存知の方、ご教授願います。 また、3 M NaSCNも試したいのですが、これの調整法もご存知の方がいましたらお教えください。

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