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(無題) 削除/引用 No.368-26 - 2007/10/27 (土) 15:14:15 - 組織 M＆Sさん >経験上ノンスペの多い一次抗体は抗原吸収を行っても陽性の反応が見られることが多いです。二次抗体由来のノンスペは一次抗体を入れない系で判定可能ですし、実際にそれが問題になったことはありません。 >僕自身は｢免染で出るノンスペはほとんど一次抗体由来であるため｣であるからと解釈しています。 わたしもそう思います。 原理的なことはともかく、実際問題になるのは一次抗体由来のノンスペでしょうね。 ノンスペが強ければ、まず一次抗体を希釈しますし、たいていはそれで問題が解決します。 二次抗体由来のノンスペも無視はできないと思いますが、非特異結合した一次抗体を二次抗体が増幅することで、バックグラウンドとして出るのだと思います。 それと、普通は二次抗体は最適化されたもの（キットなど）を使うので、問題にならないということもあるかと思います。 そう考えると、ブロッキングの目的は一次抗体の非特異結合を抑えることで、必ずしも二次抗体と同種の血清を使わなくても良いのかもしれません。 実際私も二次抗体と異種の血清をブロッキングに使ったことがありますが、きれいに染まっていました。 ただ、miyaさんがされていたように、一次抗体と同種の血清を使うのは避けるべきだと思います。 それが問題になるかどうかは別として、結果の解釈が複雑になるのはいいことではありません。 二次抗体と同種の血清を用意するのが手間なら、スキムミルクかBSAで代用すればいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.368-25 - 2007/10/27 (土) 06:40:02 - taru >Freshさま また前提として、ブロッキング溶液は3〜5％BSA溶液であり、これにどの種の血清をいれるか、を考察しているんですよね？で、No368-14にて私が「一次抗体作製種由来の血清をいれても問題ないんじゃない？」と言ったのが何いってんだこのバカわ・・なわけですよね？（笑）。誤解されているようで、私は3〜5％BSA溶液に一次抗体作製種由来の血清をいれた場合の話をしており、この条件下では ・標本上に存在する大部分はBSAであると考えられる ・一次抗体作製種由来の血清中のIgGは標本全体に「低密度」で散在している （これが吸着であれある程度の親和性をもった結合であれ、です） そのため、「高密度」で存在する抗血清IgGから得られるシグナルのほうが強いため、発色時間や抗体希釈濃度の調節によって識別可能であるとの見解に基づいています。 そしてFreshさんのNo368-19、-23の意見を要約しますと、「ブロッキングしないと、一次抗体がペタペタ標本にくっついてしまって、染色どころじゃないぞ！」と。そしてこうおっしゃります。 「正規の抗原抗体反応が非特異的吸着を凌駕するというのはそれこそ根拠のない幻想です。」 ふむ・・・私はNo368-18で「私のつかっていたかつての抗体ではブロッキングありなしで染色に違いはありませんでした」としています。 質問です。 (3)上記No368-19のFreshさんの発言を根拠に幻想を主張することは可能ですか？？　 またこれに関してはさらに質問があります。 (4)ブロッキング処理で3％BSA溶液をFreshさまは使用されるそうですが、BSAと標本の結合はFreshさまの言う「吸着」ですか？ ○No368-23「ブロッキングの本質はタンパク質が非特異的に吸着する部分に、あらかじめ適当なタンパク質を飽和吸着させ、それ以上吸着しないようにして使用される抗体の非特異的な吸着を防ぐことです」から、「吸着」が答えなのでしょう。 で、No368-23でFreshさんは言います。 「タンパク質の吸着力は馬鹿にならなくて、洗っても簡単には落ちません。ブロッキングなしでは、まず抗原抗体反応による結合より量的にも範囲も大きい吸着が一面に起こり、全体が染まってしまうでしょう。」 そこで質問です。 (5)BSAによって標本表面を完全に覆われている状態で一次抗体はどのようにして抗原を認識するのですか？ (6)スキムミルクをブロッキング溶液として使用した場合、BSAを使用した場合よりも抗原が強くマスクされると一般的にかつTOYOBOが実験結果をHPに出していますが、この違いは何に起因するとお考えですか？？

(無題) 削除/引用 No.368-24 - 2007/10/27 (土) 06:38:16 - taru >Freshさま その１ ご返答が遅れました。 流れを振り返ってみましたが、「ん〜・・」とお互いに思っていることでしょう（笑）。以下に質問をお書きしましたので、お時間がもしおありでしたら(1）だけでもお答えいただけたらと思いますｖ 根本からレスしていきます。 No368-2で「ただ、二次抗体の由来と同種の血清でブロッキングするのは、血清中の免疫グロブリンにたいして最も交叉反応しにくいから、ということでしょう。」に私が回答として疑問をもち、No368-14にて、「標識二次抗体の非特異的な結合を防ぐためじゃないの？」とレス。 ○FreshさまはNo368-23にて「ブロッキングに必ずしも血清を使わなくていいというのは、みんなわかっているとことだと思います。」と述べています。 つまり加える必要のない血清をなぜ加えるのかということがこの議論の始まりであり、その答えとして「交差性が低いから」は回答ではないでしょう？私なら「じゃぁ加えなければいいじゃん」と言い返します。私が初めに問題としたのは、 「加える必要のない二次抗体作製種由来の血清をブロッキング溶液に加えるのはなぜか？？」 という問題なのですがご理解いただけますか？No368-23における非免疫血清の使用がブロッキングとして有効とされている場合の例はへぇ〜と思いますし、この後にさらに、「こういう特殊条件下でなければ非免疫血清を加える必要はないでしょう」とかあったらふむふむと思います。 そこで質問です。 (1)「加える必要のない二次抗体作製種由来の血清をブロッキング溶液に加えるのはなぜか？？」という問題に対し、「交差性が低いから」は回答として妥当ですか？？またこの回答として私のNo368-14における前半のレスが妥当でなければ、理由も教えていただけると助かります。 そしてこの後に交差性だなんだと続くわけですが、 (2)No368-23における「ブロッキングなしでは、まず抗原抗体反応による結合より量的にも範囲も大きい吸着が一面に起こり、全体が染まってしまうでしょう。」とNo368-19「いえ、ブロッキングなしでも使える非常に優秀な抗体というのはないこともありません。」・・・どっちなんでしょう？？

(無題) 削除/引用 No.368-23 - 2007/10/26 (金) 21:38:14 - Fresh >事実私のブロッキング溶液には血清ははいっていません。また私は「抗マウスIgG抗体のヤギ血清成分に対する交差性が他の血清成分に対してよりも低いという」ことを「仮定」として同意しました。これは論理的には自己寛容を考えれがいいのですが、必ずしもそうだと強く主張するだけの根拠がないからです、あしからず。 では、あなたはブロッキングなしで一次抗体（抗血清）を直接かけたことがあるのかと聞いたわけですがそうではないらしい。ブロッキングはしているのですよね。ブロッキングによって、抗血清（あるいはネガコン用の免疫前血清）に含まれる抗体の非特異的吸着が防がれているわけです。いちどブロッキングなしで抗血清を使って御覧なさい。抗体をかけるというのは標本をタンパク質で汚しているわけで、タンパク質の吸着力は馬鹿にならなくて、洗っても簡単には落ちません。ブロッキングなしでは、まず抗原抗体反応による結合より量的にも範囲も大きい吸着が一面に起こり、全体が染まってしまうでしょう。 ＞ブロッキング溶液に一次抗体を作製した動物種の血清を加えたとしても問題ないんじゃない？みたいなことを言ったからだと思いますが、仮にそういうことをしたとしても（するのに相当な理由がある場合ですが・・）、発色の速度論を考えていただければ答えがでるかと思います。 といいますが、正規の抗原抗体反応が非特異的吸着を凌駕するというのはそれこそ根拠のない幻想です。 >事実私のブロッキング溶液には血清ははいっていません。 ブロッキングに必ずしも血清を使わなくていいというのは、みんなわかっているとことだと思います。ブロッキングの本質はタンパク質が非特異的に吸着する部分に、あらかじめ適当なタンパク質を飽和吸着させ、それ以上吸着しないようにして使用される抗体の非特異的な吸着を防ぐことです。私はあれこれ取り揃えるのがわずらわしいので、特にそうしなければならない理由がなければすべて3% BSAで済ませてしまいます。しかし、正常血清でブロッキングするのがいいといわれる理由はあります。 抗体が特に非特異的吸着しやすいものというのがあります。たとえば、材料によって抗体の定常部位に対してレセプターがあったり（Fcレセプター）、ケラチンが吸着性をもつというようなことです（この掲示板で得た情報ですが）。こういうのをブロックするためには（二次抗体とは反応しない）抗体を含むブロッキング剤が理想的で、正常血清が選ばれるわけです。

(無題) 削除/引用 No.368-22 - 2007/10/26 (金) 21:10:05 - M＆S taruさん 二次抗体と同種の血清でブロックする理由はやはりFreshさんの説明の通りだと思います。 ＞しかしながら実際的なこととして、ブロッキング溶液に二次抗体作製動物種由来の血清をいれなくてもきれいな染色を多々得ることができます。これは一次抗体として抗血清を用いた場合でも同様です。 とご自身で言っているように、確かにブロッキングの条件に左右されることはあまりありません。 自分で原理と書いたので恐縮ですが、経験上ノンスペの多い一次抗体は抗原吸収を行っても陽性の反応が見られることが多いです。二次抗体由来のノンスペは一次抗体を入れない系で判定可能ですし、実際にそれが問題になったことはありません。 僕自身は｢免染で出るノンスペはほとんど一次抗体由来であるため｣であるからと解釈しています。 これは他の方の意見も伺ってみたいところですね。

(無題) 削除/引用 No.368-21 - 2007/10/26 (金) 21:03:02 - taru >Freshさま　その２ ○「さて、ヤギで作った抗マウスIg抗体を使う場面を考えてみましょう。 ブロッキングに例えばヒツジ正常血清を使ったとします。 抗マウスIg抗体なのでヒツジIgには全く反応しないというのならいいですが、上で書いたように交差反応があるので、ブロッキングによって標本表面に吸着しているヒツジIgとも多かれ少なかれ反応しバックグランドをあげます。」 善釈してヤギ抗マウスIg抗体はヒツジIgで吸収処理しているとしますが、それでもヒツジIgを認識してしまうものもあるでしょう。いわんや吸収処理していなければ・・というお話だと思いますが、私の前述の内容から生じる疑問は、 （質問1）どの程度のヒツジIgが組織上に存在し、どの程度のヤギ抗マウスIg抗体がそれを認識するのですか？？ バックグラウンドをさげるために必要な要素は、 ・目的のタンパク質のみに非常に高い親和性をもつ一次抗体を用意し、 ・その一次抗体を非常に高い親和性をもつ二次抗体で検出する ということは同意していただければと思います。 その上で（質問1）に相当するような状況が組織上でどの程度の頻度で起こっているかを考察する必要がありませんか？？ ○「じゃあ、ヤギ抗マウスIg抗体がもっとも交差しにくい血清は何かというとヤギ由来のもの（自己免疫は抑制されているから）ということです。」 抗マウスIgG抗体のヤギ血清成分に対する交差性が他の血清成分に対してよりも低いという仮定は同意できます。と既に書いていますよｖ 恐らく疑問に思われたのは、私が、 「一次抗体と同種由来の非免疫血清をブロッキングすると全てが染まって何がなんだかわからなくなるのであれば、免疫血清を一次抗体として用いることができません。」 と、ブロッキング溶液に一次抗体を作製した動物種の血清を加えたとしても問題ないんじゃない？みたいなことを言ったからだと思いますが、仮にそういうことをしたとしても（するのに相当な理由がある場合ですが・・）、発色の速度論を考えていただければ答えがでるかと思います。 バックグラウンドがでるかでないかの議論になれば、ブロッキング溶液に一次抗体を作製した動物種由来の血清を加えた場合が一番バックが高いと思われます。それは標本上に結合したIgが二次抗体によって認識される確率が一番高いからです。これを原因とするバックはFreshさまがおっしゃり、また私も同意していますが二次抗体作製動物種由来の血清を使用することで軽減できます。血清をまったく加えないという選択肢もありでしょう。事実私のブロッキング溶液には血清ははいっていません。また私は「抗マウスIgG抗体のヤギ血清成分に対する交差性が他の血清成分に対してよりも低いという」ことを「仮定」として同意しました。これは論理的には自己寛容を考えれがいいのですが、必ずしもそうだと強く主張するだけの根拠がないからです、あしからず。 ブロッキング溶液に一次抗体作製動物種由来の血清を加えてブロッキングした状態で抗血清を加えてみてください。標本上でIgが最も多い箇所は抗血清を作製するのに使用した抗原が存在する部位です。量比の問題です。この条件下で二次抗体を加え、発色処理をした場合、どこが一番早く可視条件下に入るかということなのです。そこで失礼ながらNo.368-18でモノクロさまに質問をしたわけです。 若輩に時間をさいてくれたことにお礼を言います。

(無題) 削除/引用 No.368-20 - 2007/10/26 (金) 21:01:33 - taru >Freshさま　その１ ○「しかしながら実際的なこととして、ブロッキング溶液に二次抗体作製動物種由来の血清をいれなくてもきれいな染色を多々得ることができます。これは一次抗体として抗血清を用いた場合でも同様です。 あなたがこの実験をしたときブロッキングはしたのかしなかったのか？ということで、もししていたのなら、抗血清で「ブロッキング」してもきれいな染色が得られるというのは的はずれでしょう（実際はすでにブロッキングされているところで抗原抗体反応をしたということにすぎません）。」 →ブロッキング溶液に二次抗体作製動物種由来の血清を「「いれなくても」」きれいな染色を多々得ることができます。 BSAでのブロッキングはしています。ここで言っているのは、「二次抗体作製動物種由来の血清」をいれない場合ですよ！ そして、Freshさまがいうような、「「抗血清で「ブロッキング」」」をするなどとは書いてないです・・・orz　すいません、自分で書いた内容は他人に指摘されないと的を得ていないかどうかわかりませんが、Freshさまの論点がいまいちわかりかねました・・・

(無題) 削除/引用 No.368-19 - 2007/10/26 (金) 19:17:52 - Fresh ＞また最後の問いですが、ブロッキングしなくても特異的な染色が確認できるのであればする必要はないでしょう。というと、「んな馬鹿な！」と思われるのがオチなので、そんなことはしませんがｗ いえ、ブロッキングなしでも使える非常に優秀な抗体というのはないこともありません。もちろん抗血清のようなクルードなものではなく、精製抗体やモノクロなどですが。ブロッキングしなくても特異的な染色が確認できるのであればする必要はないでしょう、というのは言うまでもありません。問題は底ではなくて、 ＞しかしながら実際的なこととして、ブロッキング溶液に二次抗体作製動物種由来の血清をいれなくてもきれいな染色を多々得ることができます。これは一次抗体として抗血清を用いた場合でも同様です。 あなたがこの実験をしたときブロッキングはしたのかしなかったのか？ということで、もししていたのなら、抗血清で「ブロッキング」してもきれいな染色が得られるというのは的はずれでしょう（実際はすでにブロッキングされているところで抗原抗体反応をしたということにすぎません）。 ＞抗マウスIgG抗体のヤギ血清成分に対する交差性が他の血清成分に対してよりも低いという仮定は同意できます。しかし「原理」となると答えとして疑問を持ちます。 ＞二次抗体と同種由来の非免疫血清でブロッキングするのは、二次抗体に標識がついているため、二次抗体の非特異的結合による偽陽性判定を防ぐためです 正解をかみ砕いて説明しましょう。 カタログ等で二次抗体の性能の説明部分を見てみると、交差性という項や吸収処理についてかいてあると思います。 これはどういう事がというと、例えばヤギにマウスIgを免疫して、抗マウスIg抗体を作ったとします。しかし異種間でもIgは似ているので、この抗体は他の動物のIgとも多かれ少なかれ交差反応します。交差反応する抗体成分をいろいろな動物由来のIgで吸収してマウスIg以外とは反応しないようにするのが吸収処理です（どれだけ多くの動物種で吸収するかは用途やグレードによる）。 さて、ヤギで作った抗マウスIg抗体を使う場面を考えてみましょう。 ブロッキングに例えばヒツジ正常血清を使ったとします。 抗マウスIg抗体なのでヒツジIgには全く反応しないというのならいいですが、上で書いたように交差反応があるので、ブロッキングによって標本表面に吸着しているヒツジIgとも多かれ少なかれ反応しバックグランドをあげます。 じゃあ、ヤギ抗マウスIg抗体がもっとも交差しにくい血清は何かというとヤギ由来のもの（自己免疫は抑制されているから）ということです。

(無題) 削除/引用 No.368-18 - 2007/10/26 (金) 18:59:04 - taru >Freshさま ○「一次抗体をかける前に正常血清であろうとBSAであろうとそのほかであろうとブロッキングはしているのでしょう？　ブロッキングなしにマウス血清をかけてそれを標識抗マウスIgで検出したら真っ黒になると思いますけれど（そういう失敗もある）。もしそうならないなら、そもそもブロッキングなんて必要ないということではないですか？」 非免疫血清と抗血清で同条件の発色においてその結果（真っ黒になる？）が得られたというなら、かつ、ブロッキングをした場合は非免疫血清の場合と比較して抗血清での特異的な箇所でのみの染色が見られるというのであれば、私も追試し経験の修正を行う必要があります。この文章だけだと、染色時においてその抗体は使えないんじゃないの？というのが私の現時点での考えです。 また最後の問いですが、ブロッキングしなくても特異的な染色が確認できるのであればする必要はないでしょう。というと、「んな馬鹿な！」と思われるのがオチなので、そんなことはしませんがｗ　私のつかっていたかつての抗体ではブロッキングありなしで染色に違いはありませんでしたが、心の安静のためブロッキングは行っています。 >モノクロさま ○「一次抗体として使う抗血清は数千〜数万倍で用いると思います。一方、ブロッキングでは10％以下の希釈濃度で用いると思いますので、各反応液中に含まれる抗体量は相当違うことが考えられます。また、血清にはＩｇＭも相当含まれていることが推察でき、それらが非特異的に組織に吸着し、二次抗体と反応してしまう可能性が高いと思います。ブロッキングしていない組織に１０倍希釈抗血清を反応させてノンスペがないケースは限りなくレアケースではないでしょうか。」 抗血清を染色において数千〜数万倍で用いたことがないのでわかりません。100〜1000倍までの経験しかないです。一方ブロッキングに用いた血清の希釈倍数は50です。さて・・・逆に質問ですが、 ・組織上に存在する抗血清由来のIgGとブロッキング由来のIgGはどちらが多いと想定していますか？？ ・仮にブロッキング由来のIgGの方が100倍多いとして、組織上のIgGのlocalizationはどう想定していますか？？ ・なぜ最後だけ10倍希釈抗血清ですか？？ ・抗血清の特異性は高いですか？？ ・発色時間は何をもとに決定しますか？？ と、質問するとまた答える義務が生じるのでアレなのですが・・・ 染色というのは非特異的な発色がなるべく見えないような条件下で特異的な染色のみをひっぱりだすものだという認識であれば、そんなブロッキングをしないと！！！！とか言うものではないと思いますよ☆

(無題) 削除/引用 No.368-17 - 2007/10/26 (金) 18:21:07 - sea Freshさんのご指摘に一票です。 確かにこの二次抗体作成動物血清でのブロッキング、というのは 始めたばかりの頃に理解しづらいところですよね。 目的は一次抗体・二次抗体を含め、IgGの非特異的結合・吸着を 防ぐことで、二次抗体作成動物血清のほかにBSA、市販の ブロッキング溶液などをお使いの方も多いのではないでしょうか？ 一次抗体反応前にブロッキングをするだけでなく、 抗体希釈液にもブロッキング溶液を使ったりして 非特異反応を防ぐプロトコルも紹介されたりしています。 二次抗体のためだけだったら、一次抗体反応前にブロッキングしたり 一次抗体をブロッキング液に希釈する意味はないわけで。 > しかしながら実際的なこととして、ブロッキング溶液に二次抗体作製 >動物種由来の血清をいれなくてもきれいな染色を多々得ることができます。 >これは一次抗体として抗血清を用いた場合でも同様です。このことから、 多分taruさんは二次抗体作成動物由来の血清を入れていないだけで ブロッキング自体はされているのでしょう。 必ずしも二次抗体作成動物由来の血清を使わなくてもよい、というのは その通りだと思います。 ただ、文脈からはここのスレ主さんは複数のブロッキングを することは想定していないのだと思います。 まあ何でブロッキングしてもノンスペが出るときは出てしまう、 というのが真実だったりするわけですが・・・

(無題) 削除/引用 No.368-16 - 2007/10/26 (金) 17:33:09 - モノクロ 一次抗体として使う抗血清は数千〜数万倍で用いると思います。一方、ブロッキングでは10％以下の希釈濃度で用いると思いますので、各反応液中に含まれる抗体量は相当違うことが考えられます。また、血清にはＩｇＭも相当含まれていることが推察でき、それらが非特異的に組織に吸着し、二次抗体と反応してしまう可能性が高いと思います。ブロッキングしていない組織に１０倍希釈抗血清を反応させてノンスペがないケースは限りなくレアケースではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.368-15 - 2007/10/26 (金) 17:11:20 - Fresh ＞一次抗体と同種由来の非免疫血清をブロッキングすると全てが染まって何がなんだかわからなくなるのであれば、免疫血清を一次抗体として用いることができません。またコントロールとしてマウスの非免疫血清を一次抗体として使うことがありますが、全てが染まってというようなことは経験がありません。 一次抗体をかける前に正常血清であろうとBSAであろうとそのほかであろうと ブロッキングはしているのでしょう？　ブロッキングなしにマウス血清をかけてそれを標識抗マウスIgで検出したら真っ黒になると思いますけれど（そういう失敗もある）。もしそうならないなら、そもそもブロッキングなんて必要ないということではないですか？

(無題) 削除/引用 No.368-14 - 2007/10/26 (金) 16:48:56 - taru >M＆Sさま 「実験を行う上で原理をしっかりと理解しておくことはとても大切なことだと思います。」とありましたのでスルーしていましたが一言。揚げ足を取るわけではないのですが。 ○「二次抗体の由来と同種の血清でブロッキングするのは、（ブロッキングに用いた）血清中の免疫グロブリンにたいして最も（二次抗体として用いた血清中の免疫グロブリンが）交叉反応しにくいから、ということでしょう。」 *（　）内は付け加えたものです。 一次抗体をマウスで作製したとします。 二次抗体をヤギで作製したとします（抗マウスIgG抗体）。 抗マウスIgG抗体のヤギ血清成分に対する交差性が他の血清成分に対してよりも低いという仮定は同意できます。しかし「原理」となると答えとして疑問を持ちます。 二次抗体と同種由来の非免疫血清でブロッキングするのは、二次抗体に標識がついているため、二次抗体の非特異的結合による偽陽性判定を防ぐためです。 二次抗体として用いている抗体集団の中では圧倒的に抗マウスIgG抗体が多いですが、IgGに対してアフィニティー精製したものにHRPなどの標識をつけて二次抗体としているため、抗マウスIgG抗体の量に比べればかなり少量ではありますが、マウスIgG以外を認識する標識された抗体が二次抗体に紛れ込みます。これらの標本への結合を防ぐために二次抗体と同種由来の非免疫血清であらかじめ非標識IgGを結合させておくこというのが、二次抗体作製動物種由来の血清でブロッキングする理由ではないでしょうか？ しかしながら実際的なこととして、ブロッキング溶液に二次抗体作製動物種由来の血清をいれなくてもきれいな染色を多々得ることができます。これは一次抗体として抗血清を用いた場合でも同様です。このことから、 >モノクロさま ○「一次抗体と同種の血清を使うとどうなるか…。全てが染まって何がなんだかわかりません。」 この書き込みに疑問が生じます。 一次抗体と同種由来の非免疫血清をブロッキングすると全てが染まって何がなんだかわからなくなるのであれば、免疫血清を一次抗体として用いることができません。またコントロールとしてマウスの非免疫血清を一次抗体として使うことがありますが、全てが染まってというようなことは経験がありません。むしろ非免疫血清と抗血清の染色結果を比較して、同箇所が染色されている場合は、そこは非特異的な染色と判断したりします。未精製の抗血清でも特異的な染色を得ることができます。 これらのことから、以下のことが推測できます。 「通常状態におけるIgGの量は組織や細胞の染色においては標本上に結合はしているだろうが、視認できない。」 免疫染色で染色を視認できるのは、その部位に「可視化できるほどの色素が集まっている」からであり、染色が確認できないのは、可視化できるほどの色素が集まっていない」からです。

(無題) 削除/引用 No.368-13 - 2007/10/26 (金) 12:40:28 - M＆S モノクロさん、Freshさん、miyaさんの質問は僕に対してのものだったみたいですが代理レスありがとうございます。 miyaさん、実験を行う上で原理をしっかりと理解しておくことはとても大切なことだと思います。原理を知らないと失敗したときのトラブルシューティングができませんし、そもそも得たデータを読み違える可能性があります。 実験の入門書なんかは沢山ありますし、一度読まれてみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.368-12 - 2007/10/26 (金) 11:41:44 - miya モノクロさん、Freshさん、ありがとうございます。 確かになるほどです。考えればわかることでしたね。 いつも何も考えずに、10%NGSでブロッキングしていました。 この前、from goatの一次抗体にも10%NGSを使い・・・。 結果が得られなかったのもこのせいかもしれません。 ノンスペよりは染まりが出なかったので、 抗体など他の問題の可能性もありますが、 一度BSAにかえてやってみなければいけませんね。

(無題) 削除/引用 No.368-11 - 2007/10/25 (木) 20:37:09 - Fresh >「一次抗体と同じ動物種の血清は厳禁」とのことですが、どうしてでしょうか？ 聞くは一時の恥とは申しますが、、、、ちょっと考えてみてください。 ブロッキングとはなんですか？ そう、抗体が非特異的吸着をしないように、あらかじめ検出系に関係ないタンパク質を吸着させて、それ以上、非特異的な吸着が起こらないようにするのですね。 二次抗体はどういうものですか？ そう、一次抗体を特異的に検出するものですね。 ブロッキングに一次抗体と由来の同じ血清を使うとどうなるでしょう。 ブロッキングに使われた血清成分は非特異的に吸着します。 これを二次抗体で検出したらどうなるでしょう？

(無題) 削除/引用 No.368-10 - 2007/10/25 (木) 20:33:01 - モノクロ 二次抗体は何を認識して結合するのでしょう？血清中には様々な抗体が存在しており、どうしても非特異結合が生じます。ブロッキングに一次抗体と同種の血清を使うとどうなるか…。全てが染まって何がなんだかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.368-9 - 2007/10/25 (木) 19:54:47 - miya 今年から免疫染色をはじめた初心者です。 M&Sさんが、書かれていたことですが、 「一次抗体と同じ動物種の血清は厳禁」とのことですが、どうしてでしょうか？ 二次抗体と同じ動物種の血清がよいというのは、本で読んだことがありますが、この事は初めて聞きました。 よろしければ教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.368-8 - 2007/10/25 (木) 11:09:42 - プローブ DAKOのブロッキング試薬調整済み液を購入して使っています。serumFreeとかかれてますが、詳しい内容は調べてません。以前はウシ血清を調整して使ってましたが比較してみてもあまり差はないようでした。既製品のほうが安心して使えるような気がして現在はこれを使ってます。 なにかご意見があれば教えてください

(無題) 削除/引用 No.368-7 - 2007/10/24 (水) 14:24:11 - ブロッキング+ 組織 さん、レス有り難うございます。 丁寧にお答えいただき有り難うございました。 そのような意図だったんですね。 有り難うございました。

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