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(無題) 削除/引用 No.364-24 - 2007/10/26 (金) 10:39:39 - gira His tagをニッケルカラムで精製しようとされているのですよね。 他のかたのごいけんをちゃんとよんでないのですが、、、 還元剤は全くなしでやってみる。 EDTAなどキレート剤が入っていないか確認する コンストラクトのHis-目的タンパク質の間を長くする。またはN-terminalをすこし削ってみる。 （抗体作製のみの目的であれば、多少短くなろうがながくなろうが関係ありませんから） あと、可溶化ですが高濃度のUreaかGuanidineのbuffer十分量を少量のPBSなどのbufferで懸濁したペレットに直接まぜて（どろどろです）そのまま40000回転ぐらいで超遠心をかけます。じょうせいに目的のタンパク質がでてきます。 ソニケーションはいろんなことがおこるので、一度この方法も検討してみてください。 His抗体でバンドは認識されてますよね？CBBのみだけではなくて。

今までのことを調べてませんが・ 削除/引用 No.364-23 - 2007/10/26 (金) 10:22:14 - gira

(無題) 削除/引用 No.364-22 - 2007/10/26 (金) 10:06:57 - 未精製 E さん アドバイスありがとうございます。 現在、取り組もうとしている内容を再確認するみたいで、嬉しく思いました。 > どなたかが既に書いていますが私も封入体の精製を > すすめます。この時点でかなりきれいなはずですから > 尿素、またはグアニジンで可溶化後巻き戻して > トロンビン切断といった感じになるかと思います。 > ただ気がかりなのはもしHisタグが内側に入って > 樹脂に付かないのであればおそらくトロンビンの > 切断認識部位も隠れてしまって切断できないのでは > ないでしょうか。 この点に関しては今すぐにでもできると思い、今日試してみるつもりです。 （早速アドバイスしてもらった内容を試そうと思ったら、これまでの検討で菌体が底を着いてしまっていまして･･･） 今日か明日、その結果をここで報告したいと思います。 あと、Eさんがおっしゃる内容は、今私が思い描いている実験計画と同じです。 まさに気がかりなのは、これもEさんがおっしゃる通り、私が現在発現しているタンパク質はアグリやすい傾向にあるという事です。これは疎水性アミノ酸残基が全体の50%存在することに依存しているのか、どうなのかはわかりませんが･･･ このために、もし封入体で精製終了したとして、トロンビンで切断できるかどうか･･･というのも懸念しております。 まずは早速獲得した菌体で試してみます。 今後、行なうことに関しても、Eさんのおっしゃる通りの内容を思い描いております。その中でも･･･ > リスキーですがタグ無しのコンストラクションを > 作ってみることです。話からすると抗原の蛋白質は > SDS-PAGEからの切り出しを考えられている様ですから > もしそのタグ無しの蛋白質が同じように封入体中に > 発現するようであれば発現後、封入体の精製、SDS-PAGE、 > ゲル切り出しで目的の抗原が手に入るはずです。 GSTタグやTrxタグ、またはMBPタグと言うのも考えましたが、コスト的に･･･ タグを変えて、可溶性画分に目的タンパク質を持っていけて、精製が成功すれば本当に嬉しい限りですが、先程記したように、今回ターゲットにしているタンパク質はアグリやすい性質を持っておりますので、どうしようかを悩んでいます。最終手段として残しておこうかと考えたりしている訳ですが･･･ コスト的に安く済ませるには、ベクターの作り直し。 基本的にプライマーを作製するだけなので、ベクターを購入するよりもおやすいでしょう、きっと。 C末にHisタグを付けることは手持ちのpET-25bで容易にできますが、目的タンパク質をコードする遺伝子とHisタグをコードする遺伝子の間にタグを切断するような認識配列がないので･･･ おそらく、タグ無しでも封入体として発現されるでしょうし、それを今回実際観察することができるのでしょうが、きっと封入体として相当精製できていると思います。 それをSDS-PAGEに供し、エレクトロエリューションし、この封入体を抗原としてウサギに免疫し、抗体作製･･･というのが次弾の考えです。 とりあえずは、今日の封入体洗浄の結果までは近々お知らせしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.364-21 - 2007/10/25 (木) 23:47:26 - E どなたかが既に書いていますが私も封入体の精製を すすめます。この時点でかなりきれいなはずですから 尿素、またはグアニジンで可溶化後巻き戻して トロンビン切断といった感じになるかと思います。 ただ気がかりなのはもしHisタグが内側に入って 樹脂に付かないのであればおそらくトロンビンの 切断認識部位も隠れてしまって切断できないのでは ないでしょうか。 手元にあるものを使って行える他の手はHisタグを N末からC末に付け替えるという手です。問題が立体的 な障害でであればC末のHisタグであれば樹脂で認識 できるかもしれません。もうひとつの手はちょっと リスキーですがタグ無しのコンストラクションを 作ってみることです。話からすると抗原の蛋白質は SDS-PAGEからの切り出しを考えられている様ですから もしそのタグ無しの蛋白質が同じように封入体中に 発現するようであれば発現後、封入体の精製、SDS-PAGE、 ゲル切り出しで目的の抗原が手に入るはずです。

(無題) 削除/引用 No.364-20 - 2007/10/24 (水) 14:16:47 - 未精製 過剰な期待 さん アドバイスありがとうございます。 > 変性条件では見かけの結合容量が大幅に低下するので、IMACは潤沢に使う。 > 可溶化バッファで平衡化する。 そうですね･･･ 樹脂ベッド体積を今まで1mlで行なっていたので、樹脂と目的タンパク質の持つHisタグとの接触割合を増やすと言う意味で、ベッド体積の増量も考えております。 あと、これまでもきちんと可溶化バッファーで平衡化しております。 さらに一時期、樹脂への負担を気にして、まず変性剤なしのバッファーで平行化を行なった後に、変性剤入りのもので平衡化という方法をとったりもしましたが、特に効果がなかったので、可溶化バッファー１本で平衡化を行なっております。 > グアニジンを溶解度いっぱいまで溶かして使う。 やはり、グアニジンは試した方が良さそうですね･･･ でも、これまで皆さんが色々と有効となる方法を教えて下さっていますので、まずそちらを試してから行ないたいと思います。 と言うのも、私の研究室にはグアニジンがないので、まずは購入するところからのスタートですが。 > 可溶化剤によりバッファ、可溶化サンプルのｐＨが低下しやすいので、カラムアプライ直前にチェックする。 勿論、樹脂に目的タンパク質が結合しない要因としてpHも考え、アプライしたサンプルのpHを測定したのですが、本来7.0のところ、6.5-6.8と若干のpH低下が見られました。 溶出法にイミダゾール濃度勾配と並んで、pH勾配もあるのは知っております。 カタログを見て考えますと、pHが6.5位になっても結合には差し支えないように思いますが、果たしてどうなのか･･･ここのpHはきちんと合わせてから行なった方がいいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.364-19 - 2007/10/24 (水) 10:32:23 - 過剰な期待 全くレジンに吸着しないのは困りますね。 他の人のアドバイスと重複しますが、思いつくままにあげると、 まずは、封入体を精製する。 可溶化バッファーには、 グアニジンを溶解度いっぱいまで溶かして使う。 ｐＨ（〜８）、塩強度（〜０．５Ｍ）高めにする。 ノニオン系界面活性剤（〜１％）も入れる。 ＤＴＴ（〜１ｍＭ）も加える。 金属レジン 変性条件では見かけの結合容量が大幅に低下するので、IMACは潤沢に使う。 可溶化バッファで平衡化する。 可溶化剤によりバッファ、可溶化サンプルのｐＨが低下しやすいので、カラムアプライ直前にチェックする。 こんなところでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.364-18 - 2007/10/23 (火) 14:19:04 - 未精製 ssさん Rosetta-gami2のユーザーとしてのアドバイス、ありがとうございました。 > 私の扱うタンパク質はいずれも1つか2つの分子内ジスルフィドを持っていますが、 RosettaやBL21(DE3)では誘導されたタンパク質は全て沈殿しましたが、 Rosetta-Gami2では無事可溶化タンパク質を得ることが出来ました。 なるほど。 貴重な体験談、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.364-17 - 2007/10/23 (火) 12:08:04 - ss Rosetta-Gami2ユーザーです。 大腸菌内はジスルフィドの形成に不向きですので、バックボーンに必須の ジスルフィドをお持ちの場合、沈殿する可能性が高くなるように思います。 私の扱うタンパク質はいずれも1つか2つの分子内ジスルフィドを持っていますが、 RosettaやBL21(DE3)では誘導されたタンパク質は全て沈殿しましたが、 Rosetta-Gami2では無事可溶化タンパク質を得ることが出来ました。 3つのジスルフィドということで、大腸菌での発現という点において、決して 少ない数では無いと感じました。

(無題) 削除/引用 No.364-16 - 2007/10/23 (火) 11:07:36 - 未精製 じょび さん 折り返しの質問の回答、ありがとうございます。 > 破砕した後の沈殿を、4%TritonX-100を含むバッファーを入れて超音波で懸濁してしばらく振って…というのを2,3回してからウレアなりグアニジンなりに溶かします。 なるほど。 そこに界面活性剤を使用するのですね。 しかも、よく洗浄バッファーが行き渡るように暫く振る必要があると･･･。 > 「タンパク質実験ノート（上）第3版」という本の封入体からの活性再生法という部分を参考にしています。 そうですか･･･ 私の研究室は「改訂 遺伝子工学実験ノート(上)(下)」はあるものの、これはありませんでした。これを期に購入してもらうよう、先生にお願いしようかと思いました。 > グアニジンの件は、Hisタグがタンパク質内に埋もれているというのであれば、変性力の強いといわれるグアニジンであれば出てくる可能性があるかなと思って書いてみました。 いえいえ、その段階でしたか･･･私はてっきり可溶化の段階での事かと思いまして･･･申し訳ありませんでした。 グアニジンで行なったら、解決できるかわかりませんが、試してみる価値はあるでしょう。やらないよりかはやって結果を見た方がわかりやすいですからね。 > GSTタグは手持ちがあるなら試してみるのは良いと思いますが、可溶性発現しなかった場合その後どうしようもないですね。 DSCさんがTrxというのもある、とアドバイスを下さっているように、まずは現状でこれまで皆さんがアドバイスを下さった点を見直して、試してみることかな、と考えています。 その次に値が張ると思いますが、また別の新しいタグを考えたいとおもいます。 この点に関しても、アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.364-15 - 2007/10/23 (火) 10:47:13 - 未精製 DSC さん アドバイスありがとうございます。 > たしかに他のタグではだめでもGST-fusionで可溶性になる場合もあるようですが、あくまでも経験的な事柄ですよね。個人的な意見ですが、下にもHis-tagさんが書かれているチオレドキシン(Trx)-fusionの方が期待できると思います。 そうですね。 おそらく何かの資料をザッと見て言っているだけかもしれませんし･･･ チオレドキシンはチラッとしか見ていなく、詳しく理解していませんが、有力候補になりそうですね。 > Trx-fusionでの発現系構築に適したOrigami・Rosetta-gamiなどの宿主系も充実しています。 現在、Rosettaを用いて目的タンパク質を発現させています。 これは、真核生物の遺伝子を扱っているからと言う理由もありまして。 私の研究室には、発現用大腸菌としてRosettaかBL21があって、Rosettaを選んでいます。 発現を行なう際に、Origami・Rosetta-gamiも見覚えがあります。 今一度、チェックした方が良さそうですね。ありがとうございます。 > タンパク質のアミノ酸配列のプロファイルから、どの発現系が適しているかある程度予測することも重要かと思います。 現在扱っている遺伝子中には推定分子内S-S結合は３つです。多い方だとは思いませんが、そういう事項から今一度見てみると言うのもありだな、と思いました。 > もしタグを変更する場合には、単純にボスの言うなりになるよりは、いろいろな種類のタグの特色と発現させようとしているタンパク質の特質を考え合わせて自分の考えで選ばれた方が、善かれ悪しかれ結果に納得できるのではないかと思います。 そうですね。 これも、今一度見直して、最善のものはないか･･･ あと、これまで皆さんがアドバイスくださっていることを参考に現状を打破できればベストだと思い、早速取り組みたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.364-14 - 2007/10/23 (火) 09:22:00 - じょび >> 6Mウレアに溶かす前に封入体をガシガシ洗っていますか？ >これはつまり、菌体破砕残渣を･･･ということでしょうか？ >菌体破砕に用いているバッファーは300mM NaClを含む20mM リン酸ナトリウム(pH 7.0)です。 >これで何度か洗浄するという認識で正しいでしょうか？ 破砕した後の沈殿を、4%TritonX-100を含むバッファーを入れて超音波で懸濁してしばらく振って…というのを2,3回してからウレアなりグアニジンなりに溶かします。「タンパク質実験ノート（上）第3版」という本の封入体からの活性再生法という部分を参考にしています。 グアニジンの件は、Hisタグがタンパク質内に埋もれているというのであれば、変性力の強いといわれるグアニジンであれば出てくる可能性があるかなと思って書いてみました。巻き戻しはウレアより難しい印象がありますが（グアニジンで溶かした後に巻き戻しが上手くいった経験がないので）、それ以前の問題のようですし。 GSTタグは手持ちがあるなら試してみるのは良いと思いますが、可溶性発現しなかった場合その後どうしようもないですね。

個人的な意見ですが 削除/引用 No.364-13 - 2007/10/22 (月) 22:39:00 - DSC たしかに他のタグではだめでもGST-fusionで可溶性になる場合もあるようですが、あくまでも経験的な事柄ですよね。個人的な意見ですが、下にもHis-tagさんが書かれているチオレドキシン(Trx)-fusionの方が期待できると思います。一つの理由は、Trx自身が組換えタンパク質のS-Sの形成に直接関与すると考えられるからです。そのことを考慮して開発されたと考えられる、Trx-fusionでの発現系構築に適したOrigami・Rosetta-gamiなどの宿主系も充実しています。私自身も、タグなしでもGST-fusionでもMBP-fusionでも可溶性にならなかった（未精製さんと同じく、Ureaで可溶化できてもaffinityで精製できなかった）組換えタンパク質の発現が、Trx-fusionでウソみたいに可溶化して精製もうまくいきました。Trx-fusionでもうまくいかないやつもありましたが。 Novagenのカタログなどにも詳細に載っていると思いますが、タンパク質のアミノ酸配列のプロファイルから、どの発現系が適しているかある程度予測することも重要かと思います。たとえばNovagenの場合では、他のタグで可溶性が低い場合、S-Sが多ければTrx-fusion (pET-32 etc.)を、S-Sが少なければNus-fusion (pET-43 etc.)を推奨しているようです。 ちなみに、過去の蓄積データからの統計的な結果だと思いますが、「予想可溶率」はTrx-tag: 77%, GST-tag: 56%, Nus-tag: 95%…だそうです。 （参考：http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004644） というわけで、もしタグを変更する場合には、単純にボスの言うなりになるよりは、いろいろな種類のタグの特色と発現させようとしているタンパク質の特質を考え合わせて自分の考えで選ばれた方が、善かれ悪しかれ結果に納得できるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.364-11 - 2007/10/22 (月) 20:43:22 - 未精製 His-Tagさん > １つのタグにこだわるよりもいくつか発現用ベクターを検討なさってもいいと思います。お金との兼ね合いですが。 そうですね･･･ どうしてもと言う気合いがあれば、先生も動いてくれると思いますが、なかなか言い出せないのが現状です。 以前、Hisタグの有無を確認する時、ウエスタンでは･･･と先生に懸念され、１回数千円するキットが売られているのですが、それを自費で購入したりしました。 できるならば、色んなベクターを使って試したいものですが･･･ 私の研究室にあるのは、今のところ、pET-15bとpET-25bです。 HisタグをＮ末端に結合させるかＣ末端に結合させるかのどちらかの選択です。 今回発現させたタンパク質は抗体作製のために用いるので、Hisタグを簡単に切断できるようにしたいという事で、pET-15bを用いています。

(無題) 削除/引用 No.364-10 - 2007/10/22 (月) 20:35:45 - 未精製 じょび さん アドバイスありがとうございます。 > 6Mウレアに溶かす前に封入体をガシガシ洗っていますか？ これはつまり、菌体破砕残渣を･･･ということでしょうか？ 菌体破砕に用いているバッファーは300mM NaClを含む20mM リン酸ナトリウム(pH 7.0)です。 これで何度か洗浄するという認識で正しいでしょうか？ > 尿素ではなくグアニジンでやってみるとか。 尿素よりも変性力の強いグアニジンの使用も考慮していましたが、無事封入体の可溶化でき、精製時の組成としては特に影響しないファクターなのではないかと考え、使用していません。 加えて、変性力より、尿素の方がグアニジンよりもある意味、精製にはマイルドな環境ではないかな･･･と思いまして、使用しておりません。 > 全然さっぱり担体に吸着しないサンプルをバッファーで5倍ぐらい薄めて流したら何故かばしばし着いたという経験があります。 これは初耳です。 そんな事があり得るのですね･･･ 単位液量あたりの余計なタンパク質濃度が薄くなる事によって、目的のタンパク質が着きやすくになる･･･そんなところでしょうか？ > これを見かけたのは英語圏のここと同じようなフォーラムだったと記憶しているのですが、あいにく再度探すことは出来ませんでした。 お手数お掛けしました。そして、ありがとうございます。 どうしても調べるとなると、日本語についつい目がいってしまいがち。 例えば、Wikipediaも日本語よりも英語のサイトの方が詳しく書かれていることがあったりしますからね･･･

ほかのタグでもいいのでは 削除/引用 No.364-9 - 2007/10/22 (月) 20:04:52 - His-Tag 古典的ですが、チオレドキシンタグを融合させることで不溶性のタンパク質でも可溶性画分に回収できることがあります。 pET-32 シリーズなどは、チオレドキシンタグと His-タグと S-タグのマルチタグなので IMAC にも対応しています。 １つのタグにこだわるよりもいくつか発現用ベクターを検討なさってもいいと思います。お金との兼ね合いですが。

(無題) 削除/引用 No.364-8 - 2007/10/22 (月) 18:57:55 - じょび 6Mウレアに溶かす前に封入体をガシガシ洗っていますか？ 場合によってはCBB染色でワンバンドレベルまで綺麗になることがあります。全然駄目な時もありますが。 吸着しない件、以前、全然さっぱり担体に吸着しないサンプルをバッファーで5倍ぐらい薄めて流したら何故かばしばし着いたという経験があります。私の時は破砕した大腸菌の上清がサンプルでしたので、その辺の影響もあったのかもしれません。 これを見かけたのは英語圏のここと同じようなフォーラムだったと記憶しているのですが、あいにく再度探すことは出来ませんでした。あまり「薄めたら着くよ」なんていう話は聞かないので、正直私の手技の問題だったのでは？と思ったりしますが、一応。 あとは尿素ではなくグアニジンでやってみるとか。 いろいろされているので参考にならないかもしれません。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.364-7 - 2007/10/22 (月) 18:39:18 - 未精製 His さん > カラムに結合しないのですか？ > 精製標品に非特異的なタンパク質の混入があるのですか？ 目的タンパク質が樹脂に結合しません。 よって、SDS-PAGE解析を行なうと、溶出画分には非特異的なタンパク質だけしか検出されません。 > 精製後に可溶タンパク質への巻き戻しができないのですか？ 可溶化は精製前に行なっております。 リフォールディングはまだ行なったことがありません。

(無題) 削除/引用 No.364-6 - 2007/10/22 (月) 18:15:26 - 未精製 pen さん HisタグとGSTタグの比較、あとアドバイスありがとうございます。 > 一般にGSTそのものが、尿素変性後のリフォールディングにはあまり向いていない（尿素なしのバッファーに交換すると沈殿してしまう）という話も聞いた事があります。 この点を含め、GSTタグに関して、私なりに調べてみたいと思います。 > 前の方もおっしゃっているとおり、GSTに変えても、アフィニティカラム精製のみでシングルバンドになるように精製するのは難しいです。 そうですね･･･ シングルバンドにならないのならば、それ以降に追加の手順を加えて、より純度を求めていく考えです。 現在は、目的タンパク質が樹脂に全く結合しない状況。 まずは、目的タンパク質が樹脂に結合してくれれば、今後の計画が立てやすいのですが･･･

(無題) 削除/引用 No.364-5 - 2007/10/22 (月) 18:09:02 - 未精製 過剰な期待 さん、Hisさん 具体的に言いますと、精製の段階です。 Hisタグを有するタンパク質が樹脂に全く結合しないのです。 単一バンド以前の問題です。 エリューション産物のSDS-PAGE泳動像を見ますと、Hisが結合していない非特異的なタンパク質がいくつか結合しているのが観察されています。 > 免疫用の抗原作製が目的なら、金属カラムの後はSDS-PAGEからの切り出し精製が安全確実ですね。 計画としましては、アフィニティー精製産物をSDS-PAGEにアプライし、切り出すという常套手段を考えております。 あわよくば、ゲルろ過をその間に行なう予定です。

(無題) 削除/引用 No.364-4 - 2007/10/22 (月) 15:22:38 - His 「過剰な期待」さんもお書きになっていますが、いろいろやったが上手くいっていないというのは、具体的に何ができていないのですか。 カラムに結合しないのですか？ 精製標品に非特異的なタンパク質の混入があるのですか？ 精製後に可溶タンパク質への巻き戻しができないのですか？

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