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ありがとうございます 削除/引用 No.359-7 - 2007/10/23 (火) 23:30:48 - モンチッチ すべてvesicleとして分画したいのですが、 そうなると４５％sucroseとういのが微妙なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.359-6 - 2007/10/22 (月) 23:05:13 - 遠心 この分画方法、よく考えてみると、シートをとろうとしてるのか、それが壊れたベジクルをねらってるのか、微妙です。 200g上清をとって、45%supに持って来るということは、 シートなのかもしれません。 どちらをねらうかによってホモジナイズの方法が違うので、 一概には言えないのです。 ベジクルならクリアランスより小さくないととれませんし、 シートなら、あまりやり過ぎると壊れてしまうので。 シートとすると、慎重にホモジナイズしてあまり陰圧にならないように気をつける必要があります。 ただ、培養細胞で後者をやるのはなかなか難しいんです。 やり方が足りないと細胞が壊れないので。 とにかく、細胞が壊れてないとはじまらないので、 まずそれから確認して、もし壊れてなければ、 他の方法でホモジナイズした方が良いです。回数を増やすより。 細胞量が少なければ、25-27Gくらいのニードルを10回程度通してやる方法が失敗が少ないのですが、多いと大変ですからね。

わかりました。 削除/引用 No.359-5 - 2007/10/22 (月) 17:18:38 - モンチッチ 次回やるときには、 ホモジナイズした後にトリパンブルーで確認して見ます。 一度、染めてみたことはあるのですが、 だいたい青くなっていたのでいいかな〜と思っていました。 次は、しっかりと観察します。 あと、ホモジナイズはやりすぎると良くないのでしょうか？ やりすぎるとクリアランス以下に細胞が粉砕されることはないのですか？

(無題) 削除/引用 No.359-4 - 2007/10/21 (日) 23:09:09 - 遠心 なるほど。では200xgの沈殿に未破壊細胞としているのですよ。 というか、そこしかないので。 培養細胞のホモジナイズは気をつけないと破砕の効率が大変低くなります。 トリパンブルーで、ホモジナイズで大体の細胞が破壊されてるかは 確認されました？ 最初はまじめにこの試験をやった方がよいですよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.359-3 - 2007/10/21 (日) 20:34:32 - モンチッチ アドバイスありがとうございます。 二回目の遠心の条件ですが、 ４５０００×ｇの書き間違えでした。 すいません、、、。 基本的にはvesicleとして抽出したいのですが、 二回目の遠心後のどの画分をとってもあまり収量がよくないのです。 細胞を回収する時に時間がかかりすぎて、 細胞がいたんでいるのも関係あるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.359-2 - 2007/10/20 (土) 13:25:54 - 遠心 このプロトコール、かなりきわどいですねえ。 細胞を機械的に破砕した場合、 細胞膜は、大きく分けるとシート状（膜がべろっと剥がれたようなもの）とベジクル（シート状のものが破砕されて細かくなったもの）の2つの形態として単離されてきます。シート状はかなり重く、古典的には2000-1500xg位で沈殿を作ります。 ベジクルの場合は基本的に大変小さく、小胞体由来のミクロソームと近い重さ（軽さというか）になるため、2万xg以上でないと落ちてきません。 このため、モンチッチさんの方法ですと細胞膜シートを単離しておられるものと思いますが、 まず細胞膜シートの単離にはホモジナイズをかなり緩く、 昔の方法ではDounceのtypeBを使い、そうっと（ただもちろん細胞が壊れてないとだめですが）やる必要があります。 テフロンホモジナイザーでモーターでがりがり回してるとシートは壊れ、ベジクルになり、これは4500xgでは落ちてきません。 大量の細胞でされておられるので、 まずは少量で予備実験をされて、現在でのやり方で細胞膜成分がどこに来ているのかを確認された方が良いと思います。 ベジクルになってしまっているのかもしれませんし（この場合4500xg上清にきます） あるいは、細胞が破砕されてないのかもしれません（200xgの沈殿に来ます）。 もしかしたら、シートになってるけどその細胞のシートは45％より重かったり、35％より軽いのかもしれません。 出版されてるプロトコールは、それぞれの細胞でのそれぞれのラボの装置を使った場合の条件なので、 すべてその通りになるとは限らず、いろいろと調整する必要がありそうです。

細胞膜vesicleの調整方法 削除/引用 No.359-1 - 2007/10/20 (土) 00:47:44 - モンチッチ マウス系の付着細胞から細胞膜vesicleを調整したいのですが、 なかなかうまく膜画分が取れません。 条件は下記の通りです。 細胞数　2×10９細胞（10cm dishで200枚くらい）をはがして、 Buffer（Tris、NaCl、MgCl2、プロテアーゼinhibitor）に懸濁する。 ホモジナイザーで３０回ホモジネートして、200×ｇ遠心する。 上清を回収し10％になるようにsucroseをくわえる。 下層から60％、45％、35％のsucrose溶液を重層し、 最後に10％sucroseの細胞溶液を重層して4500×gで遠心する。 45％、35％のsucrose層の間を分画し、 さらに100000×gで遠心する。 ペレットを回収する。 問題点を詳しく言うと、、、 得られるタンパク量が少ない。 濃縮されていない。 どなたかアドバイスをいただけないでしょうか？

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