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(無題) 削除/引用 No.358-8 - 2007/10/22 (月) 20:16:33 - う〜んと > 野生型と変異型の両方を準備するのはより堅実そうですね。 > 少しお金がかかってしまいそうですが･･･ シーケンス反応まで持っていくクローンの数を減らせるので、場合によってはコストと時間を節約できます。

(無題) 削除/引用 No.358-7 - 2007/10/22 (月) 19:56:46 - カナマイシン >う〜んと様 ありがとうございました。 やはりプライマーの3'端ってそこまで大事なものなんですね!!　 真ん中だったら2,3個違ってても増えてしまうし。 お聞きしたいのですが、 ・やはり変異点はプライマー3'の末端に持ってこられますか？ 　それとも2-3番目くらいまではOKでしょうか？ ・ルーチンで3'端はよく言われるようにGかCにしてるのですが、 　AやTでもそれほど障害なく増えるのですよね？ 　２点目は何度か話題になっている気がしますが、念のためお聞きしたいです。 野生型と変異型の両方を準備するのはより堅実そうですね。 少しお金がかかってしまいそうですが･･･ 制限酵素サイトを作る／潰す際に困ったら是非活用させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.358-6 - 2007/10/22 (月) 18:24:23 - う〜んと ご想像のとおり、プライマーの３’末端の一番端っこの塩基を変異部位に持ってきて、PCRの条件検討すれば出来ます。 よほどゆるい条件でなければ、変異特異的に一塩基の違いで増えたり、増えなかったりしますが、必要であればアニーリング温度の最適化を。 条件検討にはグラジエント機能つきのサーマルサイクラーがあると便利ですね。 PCR酵素はExoヌクレアーゼ活性のないもののほうがいいと思います。 自信が無ければ、変異配列と野生型配列のそれぞれにプライマーを用意してみてもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.358-5 - 2007/10/22 (月) 16:52:17 - カナマイシン >う〜んと様 非常に興味があります。どのようになされるのでしょうか？ 私の経験と想像では･･･ ・プライマーの3'側に変異点が来るようにして、変異が入ってなければ増えないようにする？ ・「変異検出キット」のようなものを使って、正常型と変異型をハイブリさせて 　変異点検出型ヌクレアーゼで切断？ くらいしか思いつきません。 ご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.358-4 - 2007/10/21 (日) 22:39:32 - う〜んと 制限酵素も良いのですがPCRでも一塩基置換は検出できるので、自分は変異クローン検出用のPCRプライマーを別途用意して使っています。

(無題) 削除/引用 No.358-3 - 2007/10/19 (金) 18:18:18 - カナマイシン >中年様 圧巻です･･･ありがとうございました！ 凄いですね！　･･･私が無知なんですかね？ とにかくご紹介いただいたサイトのお陰で、制限酵素サイトを「作る」のが メジャーな手法である理由がよくわかりました。 使いこなすにはトライアンドエラーがしばらく必要そうですが。

(無題) 削除/引用 No.358-2 - 2007/10/19 (金) 15:11:14 - 中年 私は次のサイトを使っています。 http://www.dwalab.com/silent_sites.htm

「サイレント変異で制限酵素サイトを作る／潰す」ソフトウェア等 削除/引用 No.358-1 - 2007/10/19 (金) 14:29:58 - カナマイシン 以前、 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=266 にてストラタジーン社QuickChangeの原理に基づく変異導入法について ご教授いただいたものです。 アドバイスに従ってうまくワークしており （通常プライマー法、メガプライマー法ともに）、 感謝の気持ちでいっぱいです。ありがとうございました。 部位特異的変異導入について、新たな質問をさせていただきます。 部位特異的変異導入時に、最終的にはシーケンスを読むのですが、 ちゃんと変異が入ったかどうかを簡易的に調べる方法として、 サイレント変異により制限酵素サイトを作る／潰す →ミニプレorコロニーPCR後に制限酵素チェック という方法があります（上スレでお聞きしたのですが）。 潰す方は考えるまでもなく簡単なんですが、 作る方ってかなり難しくないでしょうか？ 制限酵素の認識配列がすべて頭に入ってるわけでもないし･･･ 支援ソフトウェアがあるのですか？ それとも代表的な方法論があるのですか？ それらの情報がありましたら教えていただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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