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(無題) 削除/引用 No.348-4 - 2007/10/21 (日) 16:59:20 - ats コードされたアミノ酸を変えない変異を入れてNdeIを潰す方法もありますね。 ただし、大腸菌でのマイナーコドンにしない方が良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.348-3 - 2007/10/17 (水) 22:07:41 - ~ 発現ベクターに直接クローニングせずに、 クローニング用の適当なベクターにクローニングして、 PCRでORFを増やして、blunt endにしたpETに入れればいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.348-2 - 2007/10/17 (水) 22:03:47 - NEB いくつかの方法が考えられます。 １）そのcDNAのNdeIサイトよりも上流にsingle cutの制限酵素サイトXがあり、3'末端が制限酵素サイトYであるならば、NdeI-X断片、X-Y断片、NdeI-Yベクターの３ピース・ライゲーションをする。 ２）NdeI-Y断片をまずクローニングする。できたプラスミドのNdeIサイトにcDNA由来のNdeI-NdeI断片をクローニングする。NdeI-NdeI断片は裏表２種類取れるでしょうから、表向きにクローニングされたものを選ぶ。 ３）離れたところを切る制限酵素サイトを仕込んだ5'側プライマーを使ってPCRしたインサートを使う。例えば、NEBのカタログにはBceAIという酵素が出ていて、これはACGGCの後12bpと14bpのところで切れて2ntの5'突出末端を作りますので、これを利用してNdeIの2ntとcompatibleな末端を作れます。 ４）３）と同様な方法をblunt end ligationを使って行うこともできます。もう少し制限酵素のチョイスが広がります。 他にもいろいろ考えられそうですが、ひとまず。

pETベクターへのクローニング 削除/引用 No.348-1 - 2007/10/17 (水) 21:37:43 - oz 実験初心者です。現在、微生物からあるタンパクをpETベクターにクローニングしたいと思っております。タンパクの前後に余計な配列をつけたくないのでNde�Tを使って挿入したいと思っているのですが、そのタンパクの構造遺伝子の内部にもNde�Tがあり、Nde�Tを使えません。このような場合に一般的な対策とかはあるんですか？ちなみにタンパクの構造遺伝子の内部にはNco�TとNhe�Tサイトもあります。

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