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還元剤のDTTの保存方法について トピック削除
No.346-TOPIC - 2007/10/17 (水) 18:00:21 - てん
みなさんは粉末のDTTを水溶液で保存する場合、
何で溶かしてどのように保存されているか教えていただけないでしょうか。
　
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No.346-8 - 2007/10/20 (土) 15:32:11 - AP
私はmilliQに溶かした1 Mのストック溶液を1 mLくらいずつ分注して- 20℃保存していますが、年単位で使えているようです（こういうプロトコールも結構見ます）。
粉末は安定ということになっているので、保管は4℃またはフリーザ（メーカーの指定にしたがって）に普通に入れておけば安心だと思っています。

文献等によると、DTTは室温、高pHだと数時間で100% 酸化しきってしまうくらい酸化しやすいようですが、4℃にするだけでもかなり寿命が長くなるようです。まして凍結保存なら、酸化の度合いは、たいていの用途で受け入れられる程度ではないでしょうか。

酸性だと安定性が高まるので、10 mM 酢酸ナトリウムバッファー（pH 5.2）（これはEtOH沈殿用のを薄めて転用できそうですが）に溶かして凍結保存というプロトコールもあります。
また、Fe、Mg、Niほか金属イオンが存在すると（おそらく触媒作用で）急激に酸化が進むので、EGTA, EDTAなどを入れておくということもあるようです。
これはdownstreamの実験に影響がなければ試してもいいと思います。

また、ググってみたらたまたまどこかの教授がこんな方法を紹介していました。

http://nu-distance.unl.edu/Homer/class/4/Mastery/text/DTT.html

DTTを安定性の高い還元剤のTBPと共存させて保存する方法です。
（よいDTTとわるいDTTのSDS-PAGE例も出ていて、それを見るとDTTの保存はそんなにいい加減にしてはいかんのだなあ、と思います）

(無題) 削除/引用
No.346-7 - 2007/10/20 (土) 03:55:06 - ええと
>[Re:6] Bさんは書きました :
> > DTTはあっという間に失活するので用事調製にしているのですが、
> > どうしても保存される場合は一回使い切りの小分けにして、窒素ガスで
> > 酸素を置換してから-20℃で保管するのが確実です。
>
>
> -20Cで酸素と反応して失活するのであれば粉末の状態でも
> 一度蓋を置けると多分失活が始まるという事ですよね。
> その辺りはどうされてますか?

チューブに入った空気とDTT”水溶液”が反応することによる活性の損失を減らすのが目的です。
（例は変わりますが、室温でも-20℃でも、蛋白質を長期間保存しているとメチオニン酸化します）定量性を厳密に問う実験をしていたときに、これを怠って結果が随分と変わりました。
論文によるとpH7.5、20℃におけるDTT水溶液の半減期は10hです。私の実験目的には合わないので窒素置換しています。粉末では反応性が異なります。窒素置換せずともさほど反応性は変わりませんでしたが、それも小さいボトルを購入して回転をよくしていました。
　通常の電気泳動に用いる程度であればさほど問題ないと思います。

(無題) 削除/引用
No.346-6 - 2007/10/20 (土) 01:07:05 - B
> DTTはあっという間に失活するので用事調製にしているのですが、
> どうしても保存される場合は一回使い切りの小分けにして、窒素ガスで
> 酸素を置換してから-20℃で保管するのが確実です。


-20Cで酸素と反応して失活するのであれば粉末の状態でも
一度蓋を置けると多分失活が始まるという事ですよね。
その辺りはどうされてますか?

(無題) 削除/引用
No.346-5 - 2007/10/19 (金) 18:36:05 - てん
皆さん参考になるご意見ありがとうございました。
二次元電気泳動に用いるため、DWに溶解後、-20℃
に凍結保存することに致しました。
今まで水溶液状で市販されているDTTを冷蔵保存して
1年以上用いていたのでもしかするとかなり失活していたかもしれません。
とにかく、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用
No.346-4 - 2007/10/18 (木) 00:08:52 - ええと
DTTはあっという間に失活するので用事調製にしているのですが、
どうしても保存される場合は一回使い切りの小分けにして、窒素ガスで
酸素を置換してから-20℃で保管するのが確実です。
２次元電気泳動に使う分には、そこまで厳密にならなくてもいいようですけれど。

(無題) 削除/引用
No.346-3 - 2007/10/17 (水) 21:36:29 - A
うちでもDWに溶かして１MDTT溶液にして-20度で保存ですね。

(無題) 削除/引用
No.346-2 - 2007/10/17 (水) 21:21:45 - Winter8
DDWに溶かして-20℃で保存。
ん〜〜定量的な実験には使ってないから、失活しているかはわかりません。
4℃より、ずっと長持ちするのは確かです。

還元剤のDTTの保存方法について 削除/引用
No.346-1 - 2007/10/17 (水) 18:00:21 - てん
みなさんは粉末のDTTを水溶液で保存する場合、
何で溶かしてどのように保存されているか教えていただけないでしょうか。
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