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(無題) 削除/引用 No.342-8 - 2007/10/25 (木) 01:37:09 - 血管 ＞電気抵抗さん 返事が遅れてしまい申し訳ありませんでした。 確かに、電気抵抗を測定するのが一番確実ですね。 うちには機械がないので、測れないのですが・・・ どのくらいばらつくのかのイメージが無いので、 同じ細胞数、同じ処理でnを多めにとってみますね。 (Transwellは高価ですが・・・) ご意見どうもありがとうございます！

透過性 削除/引用 No.342-7 - 2007/10/22 (月) 13:50:09 - 電気抵抗 以前に同じような系をとあるラボに勉強しに行ったことがあります。 そのラボのやり方ですとアッセイを行う前に予め上層と下層の電気抵抗を測定して"じゃじゃもれ"wellを省いてからアッセイを行う必要があるとの事でした。上層の細胞をコンスタントに良い状態で撒くのはなかなか難しいそうです。 密度が高すぎると刺激に関わらず透過性に変化がでずらく、また薄い或いは不均一だとじゃじゃもれになるからです。 均等にかつ、至適密度に撒くには細胞の増殖をある程度コントロールしなければならないのですが、いかんせんHUVECは継代ごとあるいはロット毎にキャラクターに違いが出やすいのでこのような処置が必要との事でした。 以上、参考になればと思います。

(無題) 削除/引用 No.342-6 - 2007/10/20 (土) 00:50:24 - 血管 ＞seaさん ご提案ありがとうございます。 使っている培地の蛍光強度がbasalで、 細胞を播いていないTranswellにFITCを添加したときの 下層の蛍光強度がMAXになるわけですね。 で、basalとMAXの強度がリニアな状態で測れるような希釈率を 決めておくべきである、ということですよね？ 仰るとおりですね。 早速やってみます！ どうもありがとうございます。

追加 削除/引用 No.342-5 - 2007/10/19 (金) 08:40:05 - sea すみません、カラ投稿してしまったようです。 言い忘れましたが、前述の方法で下層からのFITCシグナルの 最大値と最小値を求めることが出来るわけですが、 この最大値と最小値が「血管」さんの系で (蛍光マイクロプレートリーダーなどの測定器で) 測定できる値のrangeに入っていないとデータの信頼性が低くなります。 このため、適宜サンプリングした溶液を希釈したりする必要が 出てきます。 「血管」さんのラボですでに誰かがこのような実験をやっていて、 上層下層からのサンプリングボリュームとかそれぞれの希釈率を どうする、とかプレートリーダーの設定はどうする、とかそういうことが すでに決定されていればもちろん不要ですが。 で、この最大値と最小値を求め、希釈率などを最適化するだけならば 実は細胞をまく必要はなくて、無細胞系ですべてできます。 HUVECをまいてmonolayerを形成するまでの期間に一度 無細胞系で上記の条件検討をされてみてはいかがでしょうか？

追加 削除/引用 No.342-4 - 2007/10/19 (金) 08:09:05 - sea

(無題) 削除/引用 No.342-3 - 2007/10/18 (木) 23:36:16 - 血管 ＞seaさん とても丁寧なご返信ありがとうございます。 培地はphenol red freeのものを使っているのですが、 じゃじゃもれのデータは取っていませんでした。 早速、やってみます。 あと、細胞数も振ってみたいと思います。 どうもありがとうございます。

HUVECでの使用経験はありませんが 削除/引用 No.342-2 - 2007/10/18 (木) 09:12:53 - sea 私はHUVECでの使用経験はありませんが、ほかにレスがないようなので 参考までに私が受けた印象を書いておきます。 まず、無刺激でのバックが高い、というのは何も刺激していないwellでも 下層からもFITCの強いシグナルが検出される、ということですよね？ そのままだとHUVECがintegrated monolayerをうまく形成して いないように聞こえますが、念のために以下のことを 確認してみてください。 (1) FITCを含まない溶液のbackground signal (もしくは上層にFITCを入れない状態での下層のデータ) (2) 無細胞でtranswellだけで同じアッセイを行ったときの下層のシグナル (1) がいわば透過率0%, (2)がじゃじゃもれのときのデータになるわけです。 これらをそれぞれ合わせて測定した場合に「血管」さんの 系では無刺激細胞はどの辺に位置するデータが出るのでしょうか？ また、基本的なことですが、ノイズを減らすために、 (1)のvehicleのautofluorescenceはなるべく低い方がいいわけですが、phenol red freeのvehicleを使っていますか？ アッセイ系が最適化されていないと(サンプリングした溶液の 希釈率が高かったりして)、実際には上記(1), (2)の比較で見ると 十分シグナルは抑えられているのに絶対値だけ見ると高く 見えてしまう、ということもあるかな、と思いました。 「血管」さんのデータが上記(2)のじゃじゃもれの状態に限りなく 近いのであれば、またそれにあわせた提案をしたいと思います。

HUVECとTranswellを使った血管透過性測定 削除/引用 No.342-1 - 2007/10/17 (水) 01:04:10 - 血管 HUVECをTranswellに播いて単層を形成させ、刺激後に FITC-dextranの下層への透過性を測定したいのですが、 あまりうまくいきません（無刺激のバックが高い）。 Transwellはcorning社のポアサイズ0.4um、直径6.5mmの物を使っています（コラーゲンコート）。 HUVECは1×10^5/wellでまいて、２〜３日培養後、 MW2000kDaのFITC-dextranを加えています。 （ある文献を参考にしました。） あと、Transwellの培地交換はみなさまどのようにされていますか？ 特に上層の培地交換ですが、培地を吸うと細胞も一緒に吸ってしまう感じで・・・ 普通のdishと比べて膜への接着性が低いからなのでしょうか。 何かコツなどあれば、お教え頂ければと思います。 宜しくお願いします。

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