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(無題) 削除/引用 No.338-3 - 2007/10/16 (火) 15:14:27 - Ｔ TEV protease FAQ http://mcl1.ncifcrf.gov/waugh_tech/faq/tev.pdf What protease inhibitors are known not to affect TEV? PMSF and AEBSF (1mM), TLCK (1mM), Bestatin (1mg/ml), pepstatin A (1mM), EDTA (1mM), and E-64(3mg/ml), “complete” protease inhibitor cocktail (Roche). Zinc will inhibit the activity of the enzyme at concentrations of 5 mM or greater. Reagents that react with cysteine (e.g., iodoacetamide) are potent inhibitors of TEV protease.

(無題) 削除/引用 No.338-2 - 2007/10/16 (火) 14:21:48 - ats TAPタグ精製の経験はありませんが、GST-tagを切り離した経験はあります。 protease inhibitor cocktailは広範囲のproteaseを阻害するように混合されていますので「悪さ」をしている可能性は高いです。 目的タンパクをビーズに結合したあと、 inhibitor cocktailを加えていないbufferで洗浄してから、切り出しを行うことをお奨めします。 もしくは、TEVを阻害しないinhibitor（何かは知りません。）のみ加えるとか。

TAPタグ 削除/引用 No.338-1 - 2007/10/16 (火) 11:23:29 - するたん 初めて書きこみします。 現在カナダ留学中で、TAPタグをつけたタンパクの精製を行っています。 TAPタグはprotein G-TEV-stretavidin binging protein というコンストラクトを使っているのですが、どうしてもTEVがきれなくて、western blot で確認すると、IgG beads に残ってしまっているようです。 TAPタグ精製の経験がある、あるいは知識がある方にお伺いしたいのですが、 １．TEVを切るときのバッファーなどの条件はどうしているか 私は目的タンパクの活性を保存したまま抽出したいので、一般的なTAPのプロトコールで使われるバッファーは使っていません（といってもそんなに特殊なバッファーではありませんが）。 ２．ひょっとして、バッファーに加えている protease inhibitor cocktail が悪さをしているのでは、と思ったりしているのですが、そんなことは実際にありえるでしょうか。 何かコツのようなものがあれば何でも教えてください。 よろしくお願いします。 するたん

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