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(無題) 削除/引用 No.335-14 - 2007/10/16 (火) 15:30:09 - AP >ゲルを直接乳化させる方法について、もう少し具体的に教えていただけますで >しょうか？お忙しいところ申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。 古いフォーラムのほうに関連するトピが出ていたと思います。探してみてください。 簡単に書くと、 切り取ったゲルを乾燥して粉末状にgrindする。または湿ったままcrushする。 適当なバッファーに懸濁して、通常のemulasionを作るときのように等volのadjuvantを加えてまぜまぜして注射する。 ゲル内に含まれるタンパク量の定量はCBB染色の濃さを目安にする。 ゲルに含まれるSDSの量はたかがしれているのでそのまま使っても良いが、気にする人はバッファーで何回か洗ってSDSを抜く。 抗体が出来るためには、まず第一に細胞性免疫系によって異物として認識され攻撃されなければなりませんのが（adjuvantと混ぜて乳化させる（拡散を抑える）のもそのためですな）、タンパク質を含んだゲルも立派にその条件を満たします。

横から失礼します 削除/引用 No.335-13 - 2007/10/16 (火) 15:10:45 - mom ＞コメントいただいたKitを用いないと無理でしょうか・・・ ＞と言っても、ラボにあるのはBradford法とLowry法の試薬のみです。 FASさんが紹介しているKitはLowry法を使ったものです。 もしかするとKitは改良された方法になっているかもしれませんが。 Lowry法はBradford法に比べてSDSの影響を受けにくいようです。

(無題) 削除/引用 No.335-12 - 2007/10/16 (火) 11:59:42 - モノクロ TiterMaxも油系のアジュバントですよね。エマルジョンを形成させるのであれば変性効果も高いと思いますので、ゲルのままでいけるはずです。抗体作製に関して抗原タンパク量はあくまで目安です（10μg〜300μg/dose)。人によって成功体験が異なりますのでこれといった決まりはないと思います。ＢＳＡ等を流し大まかなタンパク濃度を計算し、数パターンで免疫してみてはいかがですか？また、TiterMaxはそれほど安いものではないと思いますので、通常のフロイントアジュバントで予備検討をしたほうが良いと思います。モノクロを取りたいのであればTiterMaxを使った方がいいケースもありますが、ある程度の力価を持つ抗血清ならば通常のフロイントアジュバントで問題ないと思います。アジュバントよりも抗原の免疫源性（ホモロジー）の方が非常に重要だと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.335-11 - 2007/10/16 (火) 02:11:27 - S ＞モノクロさん 興味深いコメント、ありがとうございます。 アジュバントとしてTiter maxを用いる予定なのですが、同等の結果を得ることができるのでしょうか。また、ゲルとフロイントアジュバントを混合する場合、ゲル断片どの程度の量（ゲル面積？タンパク量？）にアジュバントをどの程度加えればよいのでしょうか。 目的タンパクとBacb/cの相同性については調べてもいませんでした。 ゲルを直接乳化させる方法について、もう少し具体的に教えていただけますでしょうか？お忙しいところ申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。

ありがとうございます 削除/引用 No.335-10 - 2007/10/16 (火) 01:51:04 - S ＞FASさん 研究室にあるKitを用いて測定を行いたかったのですが、 コメントいただいたKitを用いないと無理でしょうか・・・ と言っても、ラボにあるのはBradford法とLowry法の試薬のみです。 最近はデンシトで定量していました。 Bio radのKit、参考にさせていただきます、ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.335-9 - 2007/10/16 (火) 01:46:57 - S ＞ssさん 完全に除去することができなかった、と判断していたのですが 何か方法が悪かったのでしょうか。 100μlのサンプルに氷冷アセトンを400μl加えてVoltexし、−80℃で１時間静置した後、14000rpmで15分遠心しています。 ほかの方からも、アセトン沈殿でSDSを除去できる、とのコメントをいただいているので、もう一度やり直してみようと思います。 ご助言ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.335-8 - 2007/10/16 (火) 01:42:39 - S ＞chさん ご助言ありがとうございます。 アセトン沈殿後のサンプルは容易にPBSに溶けます。 （溶解が困難であるとタンパク質実験系の本にも書いてあったのですが・・・） SDSが残っていることは、溶解後のサンプルを４℃で保存するとSDSが析出すること、Bradford法によりタンパクの定量ができないこと（反応液が明らかにおかしな色を呈し、またタンパク量が実際の量よりもはるかに多くなりました）、このサンプルをSDS-PAGEにかけると拡散してしまい、きれいなバンドパターンを得ることができなかったことから判断しました。 クロロホルムーメタノール法は試したことがありませんでした。 先生に、SDSを完全に除去する方法はないと断言され、それを鵜呑みにするところでした、ありがとうございます。 吸光度を測定する方法は、280nm＝0.1ABS＝0.1mg/ml、という方法でしょうか？ SDSはアセトン沈殿で沈殿してこないようなので、明日きちんと確認してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.335-7 - 2007/10/15 (月) 15:06:44 - モノクロ 切り出したゲルを数回ＰＢＳ等で洗浄後、フロイントアジュバントに直接混合して免疫しても抗体が取れてました。フロイントアジュバントは強力な変性作用がありますからね。抗体取得の成否はホモロジーも大きな注意点です。目的タンパクはマウス当該タンパクとどの程度の相同性ですか？相同性が低ければゲルを直接乳化させて免疫してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.335-6 - 2007/10/15 (月) 13:45:23 - ch そんなはずは、と思って、今、やってみましたが、 SDSはアセトンで沈殿すること無いですね。 抽出の仕方によってはアクリルアミドが抽出液に残る場合があり、 それだと有機溶媒で沈殿します。 何しろ、bis抜きの重合したアクリルアミドはエタ沈のキャリアで使われるくらいですから。 ま、でもこれはウサギに打っても、強い毒性が出ることはないようです。 SDSとは違って。 もっとも抗体ができるかどうかは別問題ですが。

(無題) 削除/引用 No.335-5 - 2007/10/15 (月) 12:59:06 - FAS <SDSが含まれているため、 <Brad ford法によるタンパクの定量ができないのですが <SDSを含むタンパクを定量する方法があれば教えていただけないでしょうか。 Bio-radのDC-protein-assay kitでは10%未満のSDSならば、いけるそうです。 (ttp://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9005.pdf) 参考までに、

(無題) 削除/引用 No.335-4 - 2007/10/15 (月) 01:24:05 - ss SDS、アセトン沈殿で沈殿してきました？ 落ちてきたそれは本当にSDSでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.335-3 - 2007/10/15 (月) 01:05:15 - ch アセトン沈殿でのぞけなかったということをどうやって判断されたのかわかりませんが、 基本的に似たような方法ですが、クロロホルムーメタノール法(Anal Biochem, 1984,138:141)でSDSをクロロホルム層に抽出するという手もあります。これはもともとSDSを除くのに良いと書かれてたと思います。 ただ問題は、この後の沈殿の可溶化なんですが。 アセトン沈殿の後はどのようにして可溶化されたんですか？ あるいは、SDSのミセルサイズは1万くらいなので、濃縮器のカットオフ分子量をそれよりも大きいのを使うと、水で薄めて何回かやれば大体SDSは除けます。 ただ次第に濁ってきてつまったり、 タンパクがカットオフよりも小さいとだめですが。 タンパク定量は、BCAでできますが、SDSで溶けてるんだったら、吸光度を測るという超古典的なやり方でもいいかもしれません。

追加です。 削除/引用 No.335-2 - 2007/10/15 (月) 00:19:49 - S すいません、文章が途中で切れてしまいました。 また、マウス等に免疫して特異抗体を得たいのですが SDSが混入した状態のサンプルを抗原に用いても大丈夫なのでしょうか。 さらにもう１点質問があります。 SDSが含まれているため、 Brad ford法によるタンパクの定量ができないのですが SDSを含むタンパクを定量する方法があれば教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

SDS-PAGEゲルからタンパクを抽出するとき 削除/引用 No.335-1 - 2007/10/15 (月) 00:12:13 - S SDS-PAGE後、ネガティブ染色を行い、 ゲルから目的のバンドを切り出し、 １％SDS、Tris buffer を用いてタンパクの抽出を行っています。 抽出後、アミコンを用いて濃縮、脱塩を行っているのですが SDSを除去することができず困っています。 氷冷アセトンを用いてアセトン沈殿も行ってみましたが SDSを除去することができませんでした。 SDSを除去する方法をご存知のかたがいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか。 また

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