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(無題) 削除/引用 No.332-4 - 2007/10/15 (月) 11:54:53 - a 酵母からダイレクトシークエンスをやっていました。 私も、seqmanさんが書かれたようにに内側にシークエンスプライマーを作製しました。 ~さんが書かれたように、一見綺麗そうに見える場合でも初めの200bpはコンタミしていて前半は読めなかったり、数本バンドが見えても全く問題なかったり、いろいろあります。 失敗したくないのであれば、とりあえず１サンプルを受託に出してみるのがいいですよ。それで駄目なら、プライマーの変更やゲル回収（できればこれは避けたいところですが）を検討してみるのが良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.332-3 - 2007/10/14 (日) 17:17:35 - seqman シークエンス用のプライマーをPCR用プライマーの数nt内側にデザインしてはどうですか？非特異バンドはPCR用プライマーの内側は配列が全く異なると考えられるので、これがいくらか混入していても内側のプライマーでは読めないはずですよね。

(無題) 削除/引用 No.332-2 - 2007/10/13 (土) 13:53:00 - ~ コロニーPCR （未精製） 一部をシーケンス反応に持ち込む で読んでいました。 AGEでは見えないけれど、PAGEだと見えるバンドは多数ありました。 何か目安が欲しいのでしょうけど、読めればOKとしか言いようがありません。 AGEできれいに1本しか見えない場合でも読めない場合はありますし、 AGEで見えるエキストラナバンドがあっても読める場合もあります。 >電気泳動で検出されないレベルであれば精製段階で 目的の配列用のアフィニティーカラムを使っているのでもない限り、 極端な長さのDNAでなければ,精製時に比率が変わることは無いと思います。 >それともきちんとゲルからバンドを切り出して コスト次第ではこちらの方がより安全です。 >プライマーはできれば変えたくないのですが、 見えないバンドまで無くすことが出来るのであれば有効でしょうが、そんなプライマーがつくれるのですか？ 自分のところの人件費を0、外注の価格を高額に計算しているのならば、 切り出して、外注先が推奨する精製をして、濃度をあわせてから送るのが一番安上がりになると思います。

ダイレクトシークエンスのサンプル準備について 削除/引用 No.332-1 - 2007/10/13 (土) 13:21:10 - sh 現在ある遺伝子のPCR増幅された断片の配列をABI3100Genetic Analyzerでダイレクトシークエンスによって決定したいと考えています。 シークエンスまでには PCR増幅→増幅産物の精製→濃度調節→シークエンス反応 という流れになると思うのですが、PCR増幅の時点でどの程度厳密に増やさないといけないのでしょうか？PCR増幅をしてゲルでバンドが1本であればよいのでしょうか？シークエンス反応のためのサンプルはかなりきれいに精製されていないといけないと聞きました。 私の実験ではPCRのサイクル数を増やすと電気泳動で非特異バンドが出てしまいます。サイクルを減らせばバンドは消えるのですが、それは電気泳動で検出されないだけで非特異な増幅はおこっているように思います。そのような場合シークエンス反応のときに余計な配列が入っていることになりうまく配列が読めないような気がするのですがどうでしょうか？ 電気泳動で検出されないレベルであれば精製段階でほとんどなくなってしまうのでしょうか？ それともきちんとゲルからバンドを切り出してシークエンスするべきなのでしょうか？ プライマーはできれば変えたくないのですが、キチンと増幅するプライマーを設計しなおす方がよいでしょうか？ シークエンス反応はプレート作成までをやっていてあとは外注しているので失敗したくありません。アドバイスをお願いします。

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