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ありがとうございました 削除/引用 No.312-7 - 2007/10/15 (月) 12:54:45 - かわさき 匿名様、Do様ありがとうございました。少量の抗体液で反応させ、洗浄回数、液量は出来る限り少なくするのですね。早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.312-6 - 2007/10/12 (金) 21:56:36 - Do 洗いのとき、液を全部吸ってませんか？ エタ沈後のDNAじゃあるまいし、それではどんどんサンプルの細胞が減っていきます。 コツは細胞のペレットの上までしか液を吸わないこと。 数十から１００ulくらい残してください。 洗いが不完全で気持ち悪かったら２回やればいいです。 でも、その程度でFACSに影響したことはありません。大丈夫です。 私のFACS用簡易免疫染色プロトコルを記しておきます。 １．細胞をエッペンに回収。３００Gで５分。 ２．５０ulくらい残し、上清をアスピレート。そのまま抗体を入れる。氷上２０分。 ３．PBSを１ml加えて、３００Gで５分。 ４．５０ulくらい残し、上清をアスピレート。（必要なら２次抗体を同様に） ５．PBSを１ml加えてFACS。 弱い細胞なら少量のFCSを加えたPBSでやってください。もっと弱い細胞なら培地で。 上記の方法なら普通はほとんどロスしません。

少ない試料でFACS 削除/引用 No.312-5 - 2007/10/11 (木) 16:43:59 - 匿名 細胞を５０μlのPBS（0.1％PBS含有）に懸濁して、栄研Fスピッツで１μlの抗体と４℃30分インキュベートしたのち、0.1％FCS-PBSを５ml加え１５００rpm5分swingで遠心してから、上清をアスピで除去。0.5mlのFCS-PBSに懸濁してナイロンメッシュを通し、FACSします。一回しか遠心しないけど洗いは大丈夫。

ありがとうございます 削除/引用 No.312-4 - 2007/10/10 (水) 21:22:44 - かわさき ティルダ様、ｈｊｈｊｋ 様。 お返事ありがとうございます。やはり理屈よりも実際やっている人の言葉には重みがありますね。早速試してみます。 かわさき

(無題) 削除/引用 No.312-3 - 2007/10/10 (水) 16:44:59 - ｈｊｈｊｋ 自分の経験では、 バッファーに0.1%くらいのBSAを入れておくことで 壁への吸着を、かなり抑えることができます。 　遠心はSwingの方が絶対にいいです。 50mlのチューブが入るバケットを使ってました。 　チューブはメーカーによると思いますが、 自分の使っていたメーカーでは、 シリコン処理していないほうが良かったです。

(無題) 削除/引用 No.312-2 - 2007/10/10 (水) 12:45:43 - ~ 回転数が上げられないのと、付着にどのような関係を考えているのか分かりませんが、 付着がロスの原因ならば、シリコナイズされたチューブとチップを使うことである程度のロスを防げると思います。

少ないサンプルでFACS 削除/引用 No.312-1 - 2007/10/10 (水) 12:37:36 - かわさき 少ないサンプルでFACSを行っているのですが、免疫染色のステップでどんどん細胞がなくなってしまい困っています。原因は遠心で回転数を上げられないため（250-500Gくらいです）チューブの側壁に付着したり、チップに付着したりしてロスしている様です。もうちょっと回転数を上げられるのか、ローターはスイングの方が良いのか、洗浄の際にもBSAを入れておいて吸着しないようにした方が良いのかなどいろいろ思案しております。どなたかロスの少ない細胞染色の方法を伝授してはもらえないでしょうか？

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