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(無題) 削除/引用 No.311-8 - 2007/10/15 (月) 18:00:02 - K もうトピックが済みになっているので、蛇足極まることですが… >普通はワザワザこういう装置を使わないのでしょうか？ うちのラボでは、適当な大きさに切ったNCMを1cm画の格子状に鉛筆で区分けして その格子の中に、サンプルを滴下しています。 ですので、数ul程度だと記述した次第です。 先入観からそう書いた訳ですね。研究者としてはよろしくない傾向です…。 >エピトープ部位の露出も影響しているんじゃないでしょうか。 なるほど…熱変性させてないのでしたね。 どうもいろいろごっちゃになってしまったようです。 結果が得られたなら、おめでとうございます。

報告 削除/引用 No.311-7 - 2007/10/11 (木) 09:16:12 - どっと aさん ｋさん Toraumiさん 回答ありがとうございました。 PVDF膜しかない、転写条件が決まらない、転写装置が使用できない、という条件が重なったための緊急避難的に組んだ実験でした。 普段はウェスタンで検討しておりますし、ドットブロットもニトロセルロース膜で行えればと考えていました。これらの背景に関するみなさんからの詳細なコメントは勉強になりました。 以下、参考までに記しておきます。 PVDF膜親水化処理後、抗原を吸着（ピペットで添加、量はウェスタンに供する量と同じ（1μlあるいは0.3μl））、乾燥後、メタノールに一瞬浸して親水化してブロッキング以下通常通り実験を行いました。結果を得ることはできました。ちなみに市販のモノクローナル抗体を利用し、ECLplusでの発光検出です。 ただし、目的の抗原がリプロービングバッファーなどで変性しないことを確認の上での決断です。メタノールで変性する抗原であれば、使えない手だと思います。toraumiさんのご指摘の通り、SDS化の有無などに関するエピトーブ露出の問題もあると思います。あくまで予備実験です。

(無題) 削除/引用 No.311-6 - 2007/10/11 (木) 00:54:26 - Toraumi ＞もし、ドットブロットやるならニトロセルロースの方が良いですよ。 aさんのところと同じで、私のいるラボでもニトロセルロースを使っています。 ＞ただし、ウエスタンに使う抗体濃度の検討なら実際の条件に近い方が良いのでは？ 私なら、 ウエスタンブロットの抗体希釈条件は、実際にSDS-PAGEをやってPVDFに転写、そしてメンブレンを短冊状に切って、抗体希釈液と反応させるかなあ。 これも同意。私は何よりも『変成タンパクと非変成タンパクの反応性の違い』が気になります。 Kさんが >一般的にウェスタンはドットブロットより高感度ですので ＞高感度である理由は、タンパク質の量に由来します。 と書いていますが、単純な量の違いだけじゃなくてエピトープ部位の露出も影響しているんじゃないでしょうか。 ＞ドットブロットはせいぜい1ul-数ul程度のタンパク質溶液しか用いることが出来ませんが 前任者から渡されたラボのプロトコロールでは、ドットブロットでも20ulアプライとなっていたので、心配になってブロット装置の説明を検索して見直してみました。『各ウェル最大1 mlまで添加できます』と書かれていたので、ちょっと安心しました； http://jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=461&goods_name=PR%20648%20Slot%20Blot%20Manifold 普通はワザワザこういう装置を使わないのでしょうか？ 膜の乾燥に関しては、 ＞PVDFはどうかわかりませんが、NCMでドットブロットする時、 抗原溶液滴下後はNCMが完全に白くなるまで乾燥させてからブロッキングします。 PVDFも同様ではないでしょうか？ というか、乾燥させないで液体に浸すと、抗原溶液中のタンパクが散逸してしまうように思われます。 私のところも同様です。『乾燥は大事』と言われていますし、その理由に関しては、Kさんと同じように想像しています。

(無題) 削除/引用 No.311-5 - 2007/10/10 (水) 14:59:54 - K >ドットブロット法により、ウエスタンブロットの抗体希釈条件を決定したい とありますが、一般的にウェスタンはドットブロットより高感度ですので、 ドットブロットで決めた抗体の希釈度でウェスタンをすると、意外にシグナルが強く出過ぎたりするものです。 サンプルの量次第ですが、ウェスタンで決めた方が抗体の節約になると思います。 というか、SDS化されてるなら、ウェスタンの方が手っ取り早いような気もします。 高感度である理由は、タンパク質の量に由来します。 ドットブロットはせいぜい1ul-数ul程度のタンパク質溶液しか用いることが出来ませんが、 ウェスタンではウェルの大きさ次第ですが、20 ul程度は行けますので、 単純に考えても、１０倍以上の感度の差があります。 >メンブレンの乾燥についても教えていただけると助かります。 PVDFはどうかわかりませんが、NCMでドットブロットする時、 抗原溶液滴下後はNCMが完全に白くなるまで乾燥させてからブロッキングします。 PVDFも同様ではないでしょうか？ というか、乾燥させないで液体に浸すと、抗原溶液中のタンパクが散逸してしまうように思われます。

(無題) 削除/引用 No.311-4 - 2007/10/10 (水) 14:53:32 - a 私も昔PVDFでドットブロットやろうと思いましたが、メンブレンを水に浸してるので、上手くブロットできなかったです。特に、界面活性剤を入れたサンプルは殆ど染み込まなかった記憶がありますが。半乾きでやってもサンプルを吸い込まなかったりブロットしてる間に乾燥したりで諦めました。 もし、ドットブロットやるならニトロセルロースの方が良いですよ。 ただし、ウエスタンに使う抗体濃度の検討なら実際の条件に近い方が良いのでは？ 私なら、 ウエスタンブロットの抗体希釈条件は、実際にSDS-PAGEをやってPVDFに転写、そしてメンブレンを短冊状に切って、抗体希釈液と反応させるかなあ。なぜなら、メンブレンの蛋白質の保持容量や抗体のバックグランドなどいろいろ検討したいので、ドットブロットではやらないかなと思います。 参考までに。

ありがとうございます 削除/引用 No.311-3 - 2007/10/10 (水) 06:01:43 - どっと traumiさん 回答ありがとうございます。 SDS化されたサンプルではなく、通常のたんぱく質溶液で試すことにします。 メンブレンの乾燥についても教えていただけると助かります。 ブロッキング処理時に特段の親水化処理は不要ですか？あおれともそもそもDWに浸したメンブレン、そんなにすぐに乾燥しないものなのでしょうか。 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.311-2 - 2007/10/10 (水) 05:44:51 - Toraumi ダメなんじゃないでしょうか。 私も初めてドットブロットする際に気になってネットで検索したことがありますが、 ＞SDS drastically reduces the binding of most proteins to blotting membranes (nitrocellulose, PVDF) という文章が引っかかってきたので、変成タンパクを試したことはありません。 SDS濃度を下げれば出来るのかもしれないし、SDS変成じゃなくて熱変成なら大丈夫な気もしますが、 変成の程度が変わりうる条件では、どっとさんの『ウエスタンブロットの抗体希釈条件を決定したい』という目的には使えないですよね。

ドットブロット法に用いるサンプルはSDS化されていてもOK? 削除/引用 No.311-1 - 2007/10/10 (水) 05:15:17 - どっと ドットブロット法により、ウエスタンブロットの抗体希釈条件を決定したいのですが、親水化したメンブレンに滴下する抗原溶液はSDS-PAGE用にSDS化したものを用いて良いか教えてください。 考えているプロトコールは次のとおりです。 １．PVDF膜をメタノールで処理後、DWに浸す ２．SDS化した抗原溶液を滴下後、風乾 （↑膜が白くなってもよいのでしょうか？洗浄は不要？） ３．ブロッキング ４．洗浄 以下、通常のウエスタンブロッテッィングと同じ 宜しくお願いいたします。

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