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(無題) 削除/引用 No.309-7 - 2007/11/26 (月) 21:16:00 - おばかちゃん みなさんご教授ありがとうございました。 いろいろと試行錯誤の結果、うまく染めることが出来ました。 DABの際のH2O2濃度と単純に2次抗体の濃度が低かったようです。 ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.309-6 - 2007/10/15 (月) 21:21:03 - C 注意すべき点： ・PBSや２次抗体のインキュベーション液にアジ化ナトリウムは入ってませんか？入っていると反応が出ません。 ・間接法では感度が弱いので、ABC法にするとか。 ・前の人も書いていますが、固定はそれでいいのですか？ちょっと弱い固定のようですが。 ・ポジコンを用意してみましょう。また、HRPが死んでいる可能性もあるので、蛍光法も同時にやるといいと思います。 ・H2O2の濃度はそれでいいのですか？あまりにも高すぎる気がします。ふつう、0.0006%位だと思いますが…。H20２の濃度が高すぎる場合、発色する前にHRPが死にます。 ・DABの濃度も高すぎやしませんか？０．０１％くらいで十分ですよ。ただ、こちらは失敗の要因にはなりにくいと思います。

(無題) 削除/引用 No.309-5 - 2007/10/11 (木) 19:19:03 - 名無し 本質的な解決策でないけど、培養細胞は蛍光抗体法でやる事が多いというか普通みんな蛍光でやっているので蛍光でやったらどうでしょうか。FITCとかテキサス赤とかみたいな。そのほうが感度も上がると思うし細かい所がきれいに見えるしいいかなあとおもう。組織ならDABが普通だけど培養細胞でDABはあまり聞かないので。

(無題) 削除/引用 No.309-4 - 2007/10/11 (木) 10:59:02 - モノクロ 組織切片のＩＨＣではＤＡＢを使ってました。今は強制発現細胞を使っているので蛍光を使ってます。発色を変えるのもひとつの手ですが、やはり過去の論文等で使われている抗体、発色法に準じて実施されるのが近道ではないでしょうか。また、今使われている抗体がＷＢとＩＨＣで反応するとすれば、メタノールではdesminがあまり変性していないため抗体が反応しないのかもしれません。リニアエピトープとコンフォメーションエピトープで実験内容は大きく変わりますからね。個人的には抗体が大きなキーを握っていると思いますので、論文で使われている抗体もしくはＩＰで使用可能な抗体を購入すれば問題が解決すると思います。

(無題) 削除/引用 No.309-2 - 2007/10/10 (水) 10:12:56 - モノクロ Dot blotでクロスしているというのは、抗desmin抗体が細胞抽出液のDot blotと反応しているという意味ですか？また、抗desmin抗体はIHCに対応していますか？染色といってもホルマリン等の固定の有無により抗原が変化することで、抗体の反応性は劇的に変化してしまうケースがあります。使用されている抗体が過去の論文等でメタノール固定でも反応しているとなれば、染色工程における問題だと思います。

免疫染色について 削除/引用 No.309-1 - 2007/10/09 (火) 22:21:36 - おばかちゃん 超基礎的な質問ですが，お願いします． 初代培養で筋細胞を培養しています．確認の為にdesmin抗体を用いて染色を行いHRP標識の2次抗体，反応液としてDABを用いていますが，論文やwesternでみられるような赤褐色が得られません．このような場合どのような事が原因なのでしょうか？ dot blotで抗体がクロスしていることは確認済みです． 手順としては 1，PBSでの洗浄 2，0.6% H2O2 in Me-OHで固定(20 min) 3，PBSで洗浄 4，0.1% Triton，4% goat serum in PBS でブロッキング(20 min) 5，anti-desmin rabbit IgGでroom temp 1h 6，PBSで洗浄 7，anti-rabbit IgG HRP標識でroom temp 1h 8，PBSで洗浄 9，0.25% DAB in PBS で10 min 10，0.4% H2O2，0.25% DAB in PBSで10 min 未筆ながらお願いします．

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