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(無題) 削除/引用 No.305-5 - 2007/10/10 (水) 17:45:20 - キヨッチ 自分はヒトアルブミンですが以下の条件で上手くいきました あるぶみんさんもホルムアルデヒド固定だと思いますが、４％ホルムアルデヒド 4℃30分固定で染色しています。いろいろ試したのですが、固定濃度、時間によってそれぞれ良く染色されるピークがありました、 それぞれの抗体をプロダクトシートよりも１０〜１００倍程度に薄めて、一次二次共にONで4℃で作用させてみてはいかがでしょう？ calf serumが気になるのであれば、一度calf serumを１０％程度加えた-PBS等で一次抗体を希釈して遠心した後に染色してみては？　その結果とコントロールを比較するとわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.305-4 - 2007/10/10 (水) 13:21:42 - CHY とりあえず発現しているかどうかを見るだけでしたら、mRNAを抽出してRT-PCRをされてはいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.305-3 - 2007/10/10 (水) 12:09:10 - 名無し 固定法は何でしょうか、というかパラホルムアルデヒドとか使ってますか。だとグリシンとかトリスとかでアルデヒドのブロッキングしてから抗体反応しないと抗体がそのアルデヒドを介して非特異的に細胞にくっついてしまいそうなる時ある、そのときは一見すごいきれいに染るけどコントロールもそうなるからこれは違うとわかる。すごい前だけどそういうことあった。やらない人もいるし本とかにも書いてないのもあるし、やらなくてもそうならないときもあるらしいけど一度そういう事あったのでそのあとはちゃんとやった。

(無題) 削除/引用 No.305-2 - 2007/10/09 (火) 16:29:59 - ats 一次抗体・二次抗体の種交差性は、ほんとに問題ないでしょうか。表記だけでは種特異性は不明です。データシートに表記されていなければELISA等でcheckしてみては？二次抗体の特異性は、一次抗体を使用せず染色すれば（いわゆるネガコンで）わかりますね。私のラボでは、多少高価でも目的抗体種以外で吸収済み二次抗体を購入しています。

培養細胞のalbumin免疫染色 削除/引用 No.305-1 - 2007/10/09 (火) 15:09:59 - あるぶみん 培養細胞のalbumin発現を見るために免疫染色をしています。 positive controlとしてrat由来高分化型肝癌細胞株(albumin発現はweでも確認済)を、negative controlとしてrat由来線維芽細胞を用いようとしたのですが、両方の細胞ともにきれいに発色してしまいます。もしかして一次抗体が,培養液中のfetal calf serumやブロッキング液のgoat serumに含まれるアルブミンに反応してしまっているのかと思ったのですが、一次抗体はrabbit anti-rat-albumin,二次抗体はgoat anti-rabbit alexa488ですから、問題はないと思っています。様々な論文を参考にして固定法や、抗体濃度、抗体反応時間、抗体反応後のwash法、など色々試したのですが、上手くいきません。細胞はどうしてもserum含有の培地を使用しなければなりません。どなたか培養細胞のalbuminを免疫染色されている方、何かよい方法を教えていただけませんでしょうか？

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