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(無題) 削除/引用 No.304-4 - 2007/10/09 (火) 15:53:59 - ats 抗体ータンパク結合もタンパク相互作用の一種です。親和性が桁違いなだけです。 つまり、高塩濃度や界面活性剤の種類によって結合が阻害されることもあります。 抗体によっては、一度結合すると安定になるものも多い（というか、そういうmAbクローンを選択する）ので、高塩濃度での洗浄が可能になります。 一度可溶化させたあと、NaCl不含液で希釈して、IPできませんか？

免疫沈降と塩濃度 削除/引用 No.304-3 - 2007/10/09 (火) 14:08:15 - sup コメントありがとうございます。 o/nでの結合反応はまだ見ておりません。上清は保存してあるのでやってみます。 界面活性剤の濃度についてですが、0.1M NaClにして界面活性剤の濃度を上げてみたことはあります。 しかし1％のtween20, tritonX100, NP40, CHAPSだといまいち可溶化せず、唯一0.1％のSDSが効きました。 しかし、指摘されているように相互作用のことを考えて、SDSはあれだなと思い、条件をいじった結果、代わりに塩濃度を上げることに行き着いた次第です。

(無題) 削除/引用 No.304-2 - 2007/10/09 (火) 04:57:02 - Toraumi 高塩濃度リパバッファは私も以前に使ったことがあります（450mM）。 ただし、その際の目的はタンパク質の複合体を壊すためであり、可溶化後（依然として複合体形成しているものと、うまく単離されたものとを選別するために）超遠心で分画したので、実際の免沈反応の際には高塩濃度ではありませんでした。 また、二つのタンパク質の相互作用の研究では、洗浄段階でのみ高塩濃度リパバッファを使ったこともあります。 私が調べていた二つのタンパク質の相互作用は、初期型は弱い結合、後期型は強い結合と言われていたのですが、高塩濃度洗浄をしてみたら感受性抵抗性が違ったという記憶があります。ただし、初期型はきれいに濃度依存的（その実験では1Mから幾つか濃度をふってみた）でしたが、後期型のほうでも塩濃度が高いと少しは結合が外れていました。 supさんの『相互作用する因子』というのがどれくらいの強度で結合しているかわかりませんが、高塩濃度リパバッファでは相互作用する相手を検出するのが難しいのではないでしょうか。 抽出バッファの組成で可溶化剤が『0.1% tween20』とかなり低濃度にしているのは、その相互作用に気を使っているからだと思われますが、（塩濃度は普通に戻して）0.5% とか1%まで上げるのはダメなのですか？　また、免沈反応時間を数時間とか一晩とかにのばしても回収率は増えないですか？

免疫沈降と塩濃度 削除/引用 No.304-1 - 2007/10/08 (月) 18:58:29 - sup とあるタンパク質の免疫沈降を試みております。 目的タンパクにはタグがついています。 目標としましては、CoIPで相互作用する因子を同定したいところです。 抽出バッファーとしては、50mM Tris pH7.6, 0.1% tween20, 1mM EDTA, 500mM NaCl を用いています。塩濃度150mMが標準的なようですが、これくらいにしないと目的タンパクが可溶化してきません。 この抽出液に、IP可能（と説明書には書いてある）抗タグアガロースを加えて免疫沈降を行いました（4℃, 1h）。 すると、確かに落ちてきますが、非常に回収率が悪いです（1割くらい）。 上清に随分残ってしまっています。 目的タンパクはそこまで大量に発現している訳ではないので、抗体量が不足しているとは思えません。 そこで伺いたいのですが、これはNaClの濃度が高すぎるのが原因なのでしょうか？500mMのNaClはWash時に使用されることのある塩濃度のようなのですが、この濃度でIPをしている論文は、探してはいるものの見つかりません。 何かご存知の方がいらっしゃいましたら、アドバイスをいただけないでしょうか。

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