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(無題) 削除/引用 No.300-9 - 2007/10/16 (火) 11:38:45 - C KpnIのような3'突出型制限酵素で切断すると高分子側にスメアを引くのでよくない（そして染色像もよくない）、という話を聞いたことがあります。 BamHIとかEcoRIを使うのがよろしい、という話ですね。

鋳型 DNA について 削除/引用 No.300-8 - 2007/10/11 (木) 18:15:05 - Eire 横道にそれますが・・・・ 鋳型にプラスミドを使っていらっしゃるなら、プラスミドについている プロモーター配列 (T3, T7 or Sp6) あるいはその外側の配列を プライマーにして PCR を行い、その産物を RNA 合成の鋳型にするという手も あります。 この場合、必要なプラスミドはごく少量（50 マイクロリットルの反応系で 10 ng もあれば十分）で済みますし、プラスミドを制限酵素で切断したり フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿も必要ないので、精製過程での ロスも気にしなくて良くなります。私は PCR 産物を一応カラム精製していますが、 しなくてもよいというプロトコールもあります（確か Ambion の HP では そう記載していた記憶があります）。 校正機能のない Taq だと 3'-end に A を付加するので、RNA 合成ではダメと言われている 3'-突出末端の鋳型になりますが、私の経験では問題になったことはありません。 気になる場合は強力な校正機能をもつ（= 平滑末端をつくる）Taq を使えば問題ないです。

(無題) 削除/引用 No.300-7 - 2007/10/10 (水) 07:46:01 - プローブ 私も以前はフェノクロ処理でDNA精製してましたが収量が悪いのと、RNAプローブ作成が上手くいかず精製の方法をキアゲンのDNA抽出キットを使用して行う方法に変更したところ上手くいくようになりました。こちらのほうが時間的にも手技的にも簡単で、RMase除去も確実に行へてよいかと個人的には思っています。以前の自分と同じようなことで悩まれているようなので一度試してみればどうですか。 それとロシュにいろいろときいてみるのもよいかと思います。

ご返事ありがとうございます。 削除/引用 No.300-6 - 2007/10/10 (水) 04:18:30 - ぽたぽた焼き 早急なるご返事ありがとうございます。 ＞takaさん 自分はプラスミド抽出ではアマシャムの抽出キットを使っています。方法はビーズを使って吸着させるものです。イラストレイテッドは確かに見やすいですね！DEPC水が悪影響を及ぼすとは存じませんでした。ありがとうございます！ ＞aさん おっしゃるとおりRNaseのコンタミチェックとしてお隣の研究室からお借りしたもので同様の処理を行いましたが結果はうまくいきませんでした。また申し送れましたが、いつもキットに付属しているコントロールDNAもポジコンとして使って実験を進めているものの、いつもRNAプローブはこのポジコンのみうまくいきます。 プラスミド抽出に関してはまさにGE（旧アマシャム社でしたね…）のFlexiPrepKitを使っています！現在は今も昔（収量が多く採れたとき）も風乾時間は25分です。aさんは普段はどれくらい風乾に時間をかけてエタノールを飛ばしていますか？ 私は、「コロニーピックアップ」→「2ml LB培養」→「8ml LB培養」を経てプラスミド抽出を行っています。以前は平均して350〜400ng/μlの収量でしたが現在は150ng/μl付近です。 ＞Yさん 確かにRNAの場合はスメアが確認されるのが普通であると思います。しかし私の場合はその範囲が異常に広く、中には上下差800bpにわたるものもあります。 プラスミド抽出に関しても同じく以前は大腸菌は増えるものの電気泳動でまったくバンドが確認できないという状況がありました。やはり同じく改めて株を換えて実験を進めた結果うまくいきました。今回も何度か別のコロニーからのピックアップを行ったのですが結果は芳しくありません。抽出キットもSIGMAのカラムを使った方法を試しましたが収量は思うように伸びず…。 ＞プローブさん 確かにDNase処理は省いても構わないかもしれません…。一度、未処理のもので実験に使ってみます！またテンプレートDNAは制限酵素処理後、エタノール沈殿とフェノクロ処理を行っています。 皆さん相談にのっていただき本当にありがとうございました。また説明が不十分だった点があるのですが、最終的にDNase処理後のRNAプローブのバンドにはセンスとアンチセンスで出来上がりに差があり、特にセンス側でどのような場合でも非常に広いスメアが確認されています。これは制限酵素を代えても解決されませんでした。フェノクロの過程ですべてのセンス側のみ中層に白い浮遊物（タンパク質？）が顕著にみられます。これは何かを意味しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.300-5 - 2007/10/09 (火) 16:34:03 - プローブ 私もロシュのDIGラベリングキットを使ってます。テンプレートのDNAは別に取り除かなくとも実際のin　situ　Hibridyzationの際には問題にならないとロシュから聞きました。そのためDNase処理はしなくても良いと思います。以前にDNase処理していた時でもラベリング反応後には適正なRNAのバンドは電気泳動で確認できましたが。テンプレートDNAの精製は行っていますか？（フェノール沈かカラムに通すかなど） それと最終的な確認で一度はラベリングスポットで確認はしたほうが良いと思います。RNAプローブの収量を確認する意味でも。

(無題) 削除/引用 No.300-4 - 2007/10/08 (月) 17:48:48 - Y 私の認識の違いかもしれませんが、 RNAを泳動した場合はきれいにバンドが確認されるというより、 スメアになってよいのではないでしょうか。 私も同じキットを使ってプローブを作製していますが、 DNase処理はしていません。 それでも特異的なきれいなシグナルが検出されています。 プラスミドの収量に関しては私も経験があります。 私の場合は大腸菌が増えてくるけど、 プラスミドが全くとれない（実際にはエタチンの段階でペレットが見えなかったのでその先はやらなかった）ことがあり、 あれこれ考える前に、transformationする大腸菌の株を換えてやりました。 それで問題無く充分プラスミドがとれました。 aさんがおっしゃるようにエタノールが残留していると収量が落ちるなど 原因はいろいろあると思いますが、以前と何もプロトコルを換えずにやって、それでも以前出来ていたことが出来ないというのは、 あれこれ原因を探るより、大腸菌を換えたり、抽出キットを換えたりした方が 早い場合もあります。道具を揃えるだけの作業ですし。

(無題) 削除/引用 No.300-3 - 2007/10/08 (月) 14:09:03 - a まず、RNaseがコンタミしていないかチェックすべきでは？ 近所のラボからDNaseを貰ってきて混ぜるだけですし。 GEのFlexiPrepを使用されていますか？ FlexiPrepはEtOHが残り易いので、気を付けた方がいいです。EtOHが多く残ってると、溶出されにくくなります。 培養スケールや収量の度合いなど教えていただけると原因がわかるかもしれません

的外れかと思いますが 削除/引用 No.300-2 - 2007/10/08 (月) 12:01:31 - taka 以前にDIG Labeling kitは使用したことあります。 ゲルからの抽出方法でグラスビーズは使用しない方が良かったです。僕はイラストレイテッド・・・だったかな、イラスト付きで分かりやすいプロトコール本（５巻くらいから成る）に記載されていたTE飽和フェノール抽出を採用しています。 あと、DEPC処理水はin vitro transcriptionに悪影響を及ぼしたような気がします。なのでテンプレートとするDNAは普通のオートクレーブ水に溶かしていました。 T7よりT3の方がかかりが良かったです。SP6は経験なし。

RNAプローブ for 「In situ hybridization」の合成について 削除/引用 No.300-1 - 2007/10/08 (月) 04:55:18 - ぽたぽた焼き いつも参考にさせていただいております。最近頭を悩ませていることがあり、こちらのフォーラムに投稿させていただきました。 現在、In situ hybridization用のRNAプローブを合成するために大腸菌を用いて大量に抽出されたDNAプラスミドを制限酵素処理したものを用いています。この際の電気泳動ではしっかりとプラスミドが切断されて一本のバンドとなっているのを確認しています。その後の過程ではRoche社の「DIG RNA labeling Kit」を使ってRNAプローブの合成を行っているのですがうまくいきません。DNase処理をする前にサンプルを電気泳動すると期待通りのバンド（上流にDNAのバンド、下流にRNAのバンド）が確認されるのですが、DNase処理後に行った電気泳動ではRNAのバンドが崩れてしまい長いスメアとなってしまうのです。使用しているDNaseもキットに同封されていたものであり、キット自体も先月購入したばかりです。プロトコール自体も忠実に従ったものであり、原因の見当がつきません。 またプローブ配列を組み込んだ大腸菌の大量培養でも最近、問題が浮上しています。最近、プラスミドDNAの抽出で得られるDNAの収量が落ちてきてしまっています。抽出プロトコールに変化も加えていないので何が原因か分りません。抽出にはアマシャム社のプラスミドDNA抽出キットを用いており、対象には１６時間かけてＬＢ培地で５５度、速度１８０で振蕩培養したものを用いています。 長くなってしまい申し訳ありません。 返信のほど、是非よろしくお願いいたします。

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