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(無題) 削除/引用 No.30-15 - 2007/08/08 (水) 09:04:16 - りり 皆さんどうもありがとうございます！ 2/20の確率で一つの平滑コンストラクトが取れました。 今後同じような問題で悩まれる方の為にログ的なものを残します。 私はLigation時間（16度o/nの暴挙）と、インサートの産物を増やす事によって解決しました。 しかし2/20では”できるようになった”というには程遠い結果だと思われます…。平滑クローニングが上手にできる方のコツのようなものをお聞きしたいところです。 残りは3種類。20個ずつつついているのですが、まだ取れていません。 でも全てのコンストラクトを同時に作っているので、 一つのプレートからアタリが出たという事で諦めずにつついてみます。 しかし、ここまで効率が悪いとは…うむむむ。 また全て取れたらご報告し、解決とさせていただきます。 カナマイシン様＞ 簡単な方のコンストラクトはカナマイシン様の仰る方法で取りました。確かに精神安定剤になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.30-14 - 2007/08/07 (火) 17:00:27 - カナマイシン >りり様 一部読み間違って（読み飛ばして？）ました。すみません。 「簡単な方」と「やっかいな方」があって、 「やっかいな方」には先にKpn/BglIIで入れて云々という方法が使えないから、 どうせならそれらを同時に作ってしまおうとお考えですよね？ まあでも「簡単な方」があるのなら、私だったらそっちだけでも 先にコンストラクトしてしまうと思います。 ある程度情報をくれるコントロールになる気もしますし。 精神安定にもなりそうですし。 もちろんそこは個人の好みですよね。 ・・・また読み違いだったらごめんなさい。独り言扱いということで。 何にせようまくいかれていることをお祈りします。

(無題) 削除/引用 No.30-13 - 2007/08/07 (火) 15:08:51 - りり 前回、コロニーが0個でしたので今回はLigation16℃でo/nという暴挙に出てみました。案の定、バックも高くなりコロニーは50個以上出ました。コントロールにベクターのセルフライゲーション産物（前回コロニー形成0個だったベクターアームと同一のもの）を形質転換していましたが、その二倍ほどコロニーが出た事になります。という事は、およそ25個は当たりかな（そんな訳ないとは思うのですが）と思いチェックをしているところです。これでうまくいっているといいのですが……。 カナマイシン様＞ ＞先に KpnI/BglII でkillせずに入れ、次にKpnIのセルフライゲーション。 そうしたいのですが、インサートする部分より更に上流にKpnIがもう一箇所、下流にもう一箇所BglIIがあるのでできません……。あまり手こずるようなら、違うサイトのアダプターを入れてみようかと思います。 インサートは500bpほどです。 また今回の結果はご報告します。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.30-12 - 2007/08/07 (火) 12:11:36 - カナマイシン インサートの配列が長かったりしないですか？ これもベクターの種類によるし、 私はpGL4は使ったことがないので何とも言えないのですが・・・ ちなみに私でしたら、ビリー様のおっしゃるコンストラクトも平行してやると思います。 先に KpnI/BglII でkillせずに入れ、次にKpnIのセルフライゲーション。 もちろん特段の事情がなければですけど。 あと、コンピは新調するかな。貧乏で買えないので作り直します。 根本的な解決にはなりませんが、どこまでうまくいってるかの確認として、 ライゲーション後にゲルに流してチェックしたりもします。 くっついてないもの、一方だけくっついたもの、両方くっついたもの、が見えたりします。 逆に両方くっついたものが明らかに見えなければ、そこまでのどこかで失敗、でしょう。 上記のようにインサートが長過ぎたり、また断片が大腸菌にトキシックな場合は、 くっついた産物は見えるにも関わらずライゲーションしてもコロニーが出なかったりします。

悩ましいです 削除/引用 No.30-11 - 2007/08/03 (金) 19:16:25 - りり KpnI cut （2hr）→Blunting high （72℃10min)→ ゲル抜き(or EtOH ppt） →精製→BglII cut →そのまま制限酵素消化液にSAP 15〜30min→泳動後ゲル抜き→精製→Ligation High 2hr→ Transform こんな感じです。ゲル抜き二回はUVが怖いと思いEtOH Pptにしたこともありましたが、結果は同じでした。

(無題) 削除/引用 No.30-10 - 2007/08/03 (金) 18:49:57 - Ｔ ということはこういう手順でしょうか？ KpnI cut → Blunting high → 72℃15分 → ゲル抜き → 精製 → BglII cut → ゲル抜き → 精製 ベクターはこれに加えて SAP 処理 違う点があれば教えてください。また、SAP はどの時点でかけているかも教えてください。

(無題) 削除/引用 No.30-9 - 2007/08/03 (金) 18:48:32 - ビリー うーん、悪いところはなさそうですね。私ならSAP処理が悪さをしてることを疑うかな。このコンストラクションならベクターをSAP処理する必要はないので、一度ナシでやってみては？

(無題) 削除/引用 No.30-8 - 2007/08/03 (金) 18:29:18 - りり >T様 おお！　新スレにまでどうもありがとうございます！案の定てこずっています。私はビビリなので、KODの活性うんぬんを考えたくないのでベクターもゲル抜きしています。なので、ほぼ完全に制限酵素消化、平滑化、SAPが効いているような気がします。バックグランドを押さえようとしたはいいけど、コロニーが出ないとへこたれます。 SAPを今回は15分ほどかけてみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.30-7 - 2007/08/03 (金) 18:16:58 - Ｔ Blunting high はKOD DNA polymerase を使用していますね。 これは耐熱性の酵素だと思うのですが、72 ℃で失活できると書いてありましたか？ ちなみにベクターの方もゲル抜きしていますか？ もししていなければ、KOD DNA polymerase がライゲーション反応に持ち込まれるわけですが、それが悪影響を及ぼしているという事はないですか？

(無題) 削除/引用 No.30-6 - 2007/08/03 (金) 18:12:55 - りり ＞ビリー様 簡単な例を最初に記載してしまいましたが、 実はこのコンストラクトだけではなく、こういうものも同時に作っています。 KpnI（BglII）（KpnI）BglII　BglII ---=========| |--------| |----- vector　insert　vector この場合に後からKpnIで切ると、KpnIで上流のフラグメントが切れてしまいまして……。なので、平滑クローニングが避けて通れない感じになってしまっています。平滑末端をPCRで繋ぐ方法を以前のスレッドでお聞きしたのですが、どうやら今後Tandem Repeatを作らなければならなくなり、同じフラグメントにPCRが引っかかってしまうので採用できない事になってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.30-5 - 2007/08/03 (金) 17:58:45 - りり 早速の書き込み、ありがとうございます。 VectorはpGL4です。 インサートはプロモーター部分なのと、同じ産物を粘着末端で切り貼りする事は簡単にできる事から大腸菌に嫌われている事はないと思います。 ちなみに、同日に同じ行程でやったEcoRVで切断後の平滑クローニングしたコロニーはちゃんと生えているので、一連の操作には問題はないのかなと勝手に思い込んでいます。Bluntingの操作かSAP処理、あとはLigation時間？に問題があるような気がしているのですが……。

(無題) 削除/引用 No.30-4 - 2007/08/03 (金) 17:53:48 - ビリー 代替法として、KpnI-BglIIでそのままクローニングし、できたプラスミドを今度はKpnI cutの後bluntingしてセルフライゲーションという手もありますよね。

(無題) 削除/引用 No.30-3 - 2007/08/03 (金) 17:51:17 - ビリー 作ろうとしているコンストラクトが大腸菌に嫌われているという可能性はありませんか。 今回はどれにも一つも形質転換体が出ていないようなので、コンピテントセルの効率が低いという可能性もあるかと思います。 ちなみにベクターは何ですか？差し障りのない範囲で結構ですので。

補足 削除/引用 No.30-2 - 2007/08/03 (金) 17:35:43 - りり （KpnI） （KpnI） 　BglII　BglII ----| |--------| |----- vector　insert　vector おっと、大変な書き間違いをしていました。 （KpnI）は両方ともKillしています。

平滑クローニングについて 削除/引用 No.30-1 - 2007/08/03 (金) 17:33:32 - りり 以前のスレッドで３フラグメントを含む平滑クローニングでてこずっていた者です。性懲りもなくまた困っているのでお助けいただければと思います。 結局、３フラグメントから平滑クローニングをする事を諦めまして、 二つのベクターから平滑クローニングを行う事にしました。 そこで、現在作製しているものは下のようになっています。 KpnI （KpnI） 　BglII　BglII ----| |--------| |----- vector　insert　vector （）内はBlunting HighというキットでKill（72度、10分）しています。 インサートのバンドは可視できる程度ありました。 UVの曝露にはかなり気を使って切り出しました（ゲルを分割して切り出しています）。VectorにはSAP処理しています（30分処理・65度15分） Ligation Highで2時間反応後、Transformationです。 この条件で5つのコンストラクト全てのプレートでコロニー0個です。 コントロールにベクターのみをセルフライゲーションさせたものを Transformationしてみましたが、やはりこれもコロニー0です。 セルフライゲーションを恐れてベクターに対する条件をきつくしましたが、 ちょっときつすぎたでしょうか。 今やり直しをしているのですが、今回は削り込みが起こり過ぎないようBluntingの際に酵素量を減して処理しました。この後、SAPをかけないべきかSAPの処理時間を短くすべきか悩んでいます。Ligationは16度でo/nしてみようと思います。ちなみに私の実験の腕は下手ですが、普通の制限酵素処理での平滑末端クローニング（SmaI EcoRVなど）はルーチンで出来ます。 平滑クローニングをルーチンでされている方々、何かポイントがありましたらご指導いただければと思います。

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