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(無題) 削除/引用 No.296-10 - 2007/10/10 (水) 15:35:35 - B 溶けにくい蛋白質や、結合蛋白質の共精製を避けるため、〜2%SDSで可溶化してから、20倍くらいまで薄めてIPとか、2-DPAGEとかすることが時々ありますが、このときの希釈液にはNP40とかTriton x100とか非イオン性界面活性剤を最終濃度1%くらい入れます(SDSの終濃度の８倍くらいになるように）。化学に素人ゆえ詳細はよく分かりませんが、SDSとこれら非イオン性界面活性剤は蛋白質の再不溶化をあるていど抑えるとともに、SDSとミセルを作ってSDSの変性効果を減弱させるのだと習いました。だから両者が共存している可溶化剤はいかがなものか？と思ったのです。 経験では、バックが高いときは、１次抗体の後の洗いを、液量、回数、時間を増やすとだいぶ改善されることが多いです。抗原と抗体の結合はとても強固で、一生懸命洗ったくらいでは、そう簡単には外れませんから、大丈夫です。膜の端の方がとくに汚く見えるときはなるべく大きめのタッパーを使い液量を多くするといいです。

古い方の掲示板にこんなスレがあります 削除/引用 No.296-9 - 2007/10/09 (火) 04:28:12 - Toraumi 別の抗体の話ですが、複数の方々がSANTA CRUZ社の抗体の善し悪しについて議論しています。 参考になるのではないでしょうか。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4498

(無題) 削除/引用 No.296-8 - 2007/10/09 (火) 00:27:50 - ぱお たくさんのご教授ありがとうございます。 ぜひ参考にさせていただきます。 気になったのがBさんの「SDSが入っているのでNP-40は入れなくていい（というか入れない方がいい）」とのコメントですが、「入れない方がいい」というのはなぜでしょうか？初めて受けたご指摘であり、私も未熟ですので是非教えて頂けたらと思います。 あと、実験を行っていて気になるのが、westernでこのPepT1の場合はバックがかなり濃くなります。blockingは5%スキムミルクで１時間、洗浄は一次抗体反応、二次抗体反応後にそれぞれTween/PBSで５分×３回行っています。 同じようにCaco-2細胞からタンパクを抽出し、他にも５種類ほどのタンパクのwesternを行ってきましたが、ここまでバックが濃くなるのは初めてです。 これも抗体が原因なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.296-7 - 2007/10/08 (月) 00:53:01 - Ｔ タグを付けた PepT1 をトラジエントで発現させて、抗タグ抗体と抗 PepT1 抗体でウェスタンすれば、抽出法の問題なのか抗体の問題なのかはっきりするのでは？

(無題) 削除/引用 No.296-6 - 2007/10/07 (日) 22:06:49 - B １６回貫通膜蛋白質ということですが、そのRIPAbufferで可溶化できますか？　SDSが入っているのでNP-40は入れなくていい（というか入れない方がいい）のではないかと思います。スタッキングゲルも切り取らずにウェスタンで見ていますか。サンプルを加熱処理なしでやってみましたか。膜蛋白質はいろいろな点で特別なので、普通の蛋白質の時と同じようにやってもうまくいかない事があります。

追加 削除/引用 No.296-5 - 2007/10/07 (日) 20:13:58 - taka 16回膜貫通の質問の続きだったんですね。 1レーン辺り25マイクログラムは少ないかもしれません。思い切って50-70くらいは流しても泳動乱れません。膜蛋白ならコンテントは低いと思いますから。 あと高分子量なら、濃度薄いゲルでしっかり流してください。 それと今あるsantaの抗体で、一か八かで免疫沈降して、産物を流してみてはどうでしょうか？免疫沈降できる抗体かどうかも不明ですが・・・特にsantaさんの抗体は大抵IPできるとか書いてありますから！！！ 頑張ってください。

市販抗体なんて 削除/引用 No.296-4 - 2007/10/07 (日) 20:04:04 - taka その蛋白に関しては知りませんが、市販抗体なんて半分以上workしません。カタログにwesternの結果が載っていても駄目なものもあります。強制発現蛋白なら認識できるけど、微量な内在性蛋白を検出できるかどうかは不明というものも多々あります。論文で誰かが使用しているものがある程度確実ではないでしょうか？ westernだけならモノクロよりポリクロの方が理論的に検出しやすいでしょう。経験的にgoatはお薦めできません。rabbitが無難では。

(無題) 削除/引用 No.296-3 - 2007/10/07 (日) 17:08:45 - ぱお メッセージありがとうございます。 抽出にはRIPA buffer (1%NP-40, 1%SDS, 1%sodium deoxycholate, 25mM Tris HCl. 150mM NaCl) を用いています。 プレートに接着した細胞にRIPA buffer を添加し、ピペッティングで回収した後、超音波、遠心、上清回収を行い抽出しています。 抗体を買い直したいのですが、どれがよいのか本当にわかりません。。。

(無題) 削除/引用 No.296-2 - 2007/10/07 (日) 16:23:16 - 教えて下さい。 抗体が全く働かない事はよくあるので、ここでさらに条件検討に時間をかけるより、少し高いものでも買い直したほうが得策かもしれません。ただその前にチェックしてほしいことがあります。細胞からの蛋白質抽出はどのようにしているのでしょうか。細胞内局在や溶解性によっては、今のやりかたでは、見たい蛋白質が抽出できない可能性は無いでしょうか。SDS sample bufferで細胞を溶かして超音波処理したもの（ほぼ全ての蛋白質は可溶化されると思う）でやってみたことはありますか。

PepT1タンパクの一次抗体 削除/引用 No.296-1 - 2007/10/07 (日) 16:08:13 - ぱお 現在、Caco-2細胞からPepT1タンパクをwesternで検出しようと試みています。 抗体はサンタクルズのものを使用しております。 しかし、条件検討を行っているのですがシグナルが確認できません。 他の論文をみてもサンタの抗体を使用したものは見つからず、ペプチド抗体を作製したり、他の方から譲ってもらったものを使用している論文ばかりです。 私が使用しているサンタの抗体はダメなのでしょうか？

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