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(無題) 削除/引用 No.294-16 - 2007/11/17 (土) 10:37:56 - X リアルタイム様 もしよろしければ、保存実験に用いたチューブ（0.5ml、1.5mlチューブ）はどちらのものを御使用でしょうか？ うまくいったチューブを使用してみたいと考えております。 ご教授いただければ幸いです。

（おそらく）解決。 削除/引用 No.294-15 - 2007/10/21 (日) 20:11:11 - りあるたいむ 0.5mlチューブに保存しておいたスタンダード溶液を、1週間以上たってからリアルタイムRT-PCRにかけてみました。すると、スタンダード溶液希釈当初と全く同じ綺麗な増幅が見られました。（段階希釈に従って等間隔に増幅曲線が立ち上がっている。）また、PCR効率の目安となる、slopeは-3.3〜3.5と、理想的な値が保たれていました。（-3.3のときPCR効率100%を意味する） 一方、1.5mlチューブに希釈したスタンダード溶液は、ランする度に増幅のタイミングがバラバラという結果になりました。しかもslopeは-4〜5という異常な値になりました。 以上の結果を踏まえ、このトピックで提案された”吸着”は思いの外効いているのではないかという結論に達しました。吸着の程度は、チューブによって差がある（たとえ同じロット番号でも）ために、例えば10^7スタンダード溶液を入れたチューブではほとんど吸着が起こらないのに10^6スタンダード溶液を入れたチューブではすごく吸着が起こる（→すると10^7スタンダードの増幅曲線と10^6スタンダードの増幅曲線の間が妙に開くことになる）、という結果になると考えられます。 しばし、サーモンスパームなどのキャリアDNA溶液を使ってスタンダード溶液を希釈するといいという話をききますが、私はこの意味を、単純にスタンダードDNAの分解を抑えるためだというふうに解釈しておりました。しかしチューブへの吸着を考えたとき、（スタンダードDNAよりも）大量のキャリアDNAが存在すればキャリアDNAのほうが吸着しやすいことになり、従ってスタンダードDNAが吸着してしまうのを防ぐという効果もあることをはじめて知りました。 どうしてもキャリアDNAを使いたくないと言う場合には、低吸着を謳っているチューブが有ればそのような製品を使うのも手でしょう。 皆様の熱心な議論・有用なアドバイスに大変感謝しております。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.294-14 - 2007/10/11 (木) 09:29:27 - りあるたいむ ころんさん、APさん、レスありがとうございます。 低濃度の核酸（でも何でも）を長期保存するのは良くないというのはよく耳にしますが、その理由はそういうところにあったんですね。 このトピックの前半の方で出てきた、”吸着”について洞察を得るため、普段使っている1.5mlエッペンチューブとは異なる0.5mlチューブに、スタンダード溶液を保存してみました。すると驚くことに、今まで困っていた現象（段階希釈がバラバラ，各スタンダードの増幅曲線が全体的に右にシフトするなど）が全く起こらなかったのです。ただ、0.5mlチューブに保存するようになったのはつい最近のことなので、もう少し時間が経つと何か変化が起こってくる可能性はありますので、様子を見る必要があるでしょう。 また、スタンダード溶液をもう一度1.5mlチューブに作ってみて、問題が再現されるかどうか試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.294-13 - 2007/10/10 (水) 21:18:56 - AP >>ちなみに「良くない」理由は主に凍結融解の際の分解なのだと感じていました >Toraumiさんがおっしゃっているように当教室でも同じようなことを >言われています。水で保存した場合、特に低濃度のDNAは分解されることが >おおいと指導教官に以前言われました。水の分子運動が影響するとかなんとか >言っていました。 qPCRサンプルの希釈とはちょっと話がそれますが一般論として、 凍結融解を繰り返すと水の結晶化にともなう（？）物理的なせん断力がかかって分解が進むということはあるでしょう。 また、水分子の攻撃によって溶質の分解が進むということもあるでしょう。 とくに、濃い溶液のほうが溶質に水和して水分子の動きがクエンチされて攻撃力が弱まるとでしょうし、逆に希釈した状態では少数の溶質が集中攻撃の的になるので、薄い溶液のほうが分解が進みやすいということはありそうです。 酵素標品の保存液や反応溶液にBSAなどのタンパク質が添加されることが多いのは、吸着によるロスを防ぐとともに、総タンパク質の濃度を高く保つことで相対的に酵素が攻撃されるのを防いでいるのだと理解しています。 同様に、DNAを希釈したスタンダードにもcarrier DNA/RNAを加えるれば保存性、安定性を高められる、という見込みはあると思います。

(無題) 削除/引用 No.294-12 - 2007/10/10 (水) 15:14:17 - ころん 私もReal-time PCRの実験を少々やっております。 しかし、そこまで専門家ではないので間違ったことを言っていたら指摘お願いします。 スタンダードは やはりプラスミドに入れたものがよりきれいにスタンダードカーブを引ける印象があります。やぱりプラスミドなので保存期間や凍結融解で分解しずらいと思われるし、理由は分かりませんがゲル抽PCR-productより低コピーまできれいに引けました。 また、スタンダードは用事調整がベターです。 しかし、私はPCRがうまく行くもので短期間にやる場合は 作りおきをリサイクルしています。 低コピーの領域はへなる場合もありますがそれほどではありません。 私の場合は、サイバークリーンでそれぞれものによりますが100コピーくらいが限界でした。 また、Taqmanのようにプローブは低コピーに強いようです。 私の場合、数gene比較しましたがTAKARA EASY DilutionでもH2Oでもそれほど差が出ませんでした。 上で書いたものはあくまでも低コピーのばらつき対策での話です。。。 りあるたいむさん以外のラボの方がうまくスタンダードが引けていて、比較的コピー数があるところがおかしくなるとすると、もしかすると、技術的なことろに問題があるかもしれません。 例えば、チューブやパラフィルムの上で8マイクロずつ水を分注し、10マイクロチップの2マイクロにメモリがあるチップを利用して、メモリを見ながら2マイクロずつ加え、ピペッティング、タッピング、チビタンをしてMixしていく。どうでしょうか？ 的外れでしたらごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.294-11 - 2007/10/10 (水) 13:53:22 - りあるたいむ 皆様、レスありがとうございます。 吸着という現象は無視できないものである気がしました。うちのラボの師匠（リアルタイムPCR経験の長い）によると、ガラス容器ならまだしも、最近のエッペンチューブなどでは吸着は無視できるのではないかという見解でした。しかしAPさんが教えてくださった論文を読みますと、吸着が原因かは別として、スタンダード溶液を水で希釈することの問題点がはっきりしてきますね。 ただ、何年も前に作って（もちろん水で希釈）-20℃保存されていたスタンダード溶液でさえ、うまくいく例もある点を踏まえると、吸着しやすさもロットによってかなりバラツキがあると考えられます。

吸着 削除/引用 No.294-10 - 2007/10/10 (水) 12:33:07 - やまさき 吸着の可能性が高いと思いますね。鮭精子ゲノムDNAやニシンのそれが良く使われますが、DNAだからちょっと気持ち悪いですね。私は分子生物学グリコーゲンを使っています。これは私の先生が教えてくれた方法で、濃度は0.1γ/λで使っています。

(無題) 削除/引用 No.294-9 - 2007/10/10 (水) 10:07:21 - mugimaki real timeを少々扱っています。 参考になればと思い書きます。 希釈したプラスミドを一応冷凍保存しています。 検量線を書き直す際に一応使用してみて問題なければいいのですが、 多くの場合結構ずれます。 その際はプラスミドを再度精製・希釈をしなおしています。 こちらで問題になることはreal timeの手技によるばらつき以外は 今まで問題になったことがありません。 >ちなみに「良くない」理由は主に凍結融解の際の分解なのだと感じていました Toraumiさんがおっしゃっているように当教室でも同じようなことを 言われています。水で保存した場合、特に低濃度のDNAは分解されることが おおいと指導教官に以前言われました。水の分子運動が影響するとかなんとか言っていました。 その場合、一応ｰ80℃で保存するか、中長期的にはエタノールでストックする のがいいと聞きました。 Toraumiさんがおっしゃっているように 希釈したばかり（新鮮なものの）方がplasmidのコピー数は正確であると 認識しています。 吸着に関しては当方あまり気にしてませんでしたが、このスレッドを見て なるほどなぁと痛感しております。 ＡＰさんがおっしゃられているように希釈手技に関しては、液量が誤差を 大きくしますので、（volumeが少なければピペット誤差が出やすい）その辺は 留意して私は希釈しています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.294-8 - 2007/10/10 (水) 09:24:21 - AP ＞例えばサンプルチューブを保存しているチューブへの吸着を考えた場合、この吸着というのは何らかの操作ではがせるものなのでしょうか？　 いったん吸着してしまったものをはがすのは難しいのではないかと思います。 たとえば、放射性ラベルしたDNAをチューブから吸い出した場合、チューブに残った分に新鮮なバッファーを加えて洗液を回収をすることを何回か繰り返しても完全には活性をとりきることはできません。ごく微量と言って良いのですが、最初から微量のDNAで定量性が求められる場合、影響は大きいでしょう。 酸、アルカリ、有機溶媒や強力な界面活性剤などを使えばあるいははがせるかもしれませんが、そうもいかないですし。 ＞だとしたら、スタンダードサンプルはキャリアDNA溶液で段階希釈したり、また吸着しにくいようなシリコナイズされたチューブを使うなどしてみたいと思います。ただこれらはお金のかかることなので、 TAKARA EASY Dilutionの添付説明書には 「鋳型DNA またはRNA を滅菌水やTE で希釈すると、チューブへの吸着 などにより正確な希釈ができない場合があるが、本製品を用いると低濃 度までの正確な希釈が可能となる。また、本製品は、キャリアーとして tRNA やrRNA などの核酸を使用していないので、それらの配列に起因 する非特異的増幅の問題が生じることもない。」 と、吸着によるArtifactについて言及していますね。 pdf↓ http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/9160_DS_j.pdf 論文の中ではqPCRサンプル／スタンダードの希釈carrierとしてsalmon sperm DNAやウシ胸腺DNA、あるいはyeat tRNAを使っているものがよくあるみたいです。 安価な試薬ですし、目的のPCRに干渉しない場合は、そういうのでいいのではないでしょうか。 次の論文では、水で希釈した場合と、carrier tRNAで希釈した場合の比較が出ています。水では希釈が大きくなるにつれ、Ctが大きくなって直線性がなくなってしまうというartifactが、tRNA添加で防げることが示されています（ただしcDNAの希釈ではなくRT時のRNA templateの希釈の実験例のようです）。 この著者も吸着によるロスだろうと考えています。discussionでほかのポリマー、たとえばlinear polyacrylamideでも同等の効果があったといっています（data not shown)。Easy Dilutionもこれでしょうかね。 http://www.clinchem.org/cgi/reprint/50/3/509.pdf poly dI-dCなんかの人工DNAなんかも選択肢のひとつかなと思いますが、salmon sperm DNAなんかよりはるかに高価ですから避けたいところですね。

段階希釈したスタンダードサンプルって保存するものなのですか？ 削除/引用 No.294-7 - 2007/10/08 (月) 23:45:27 - Toraumi 私は時々しかリアルタイムPCR定量はやらないのですが（しかもリアルタイムは半年くらい前に始めたばかり）、 スタンダードは常に用事希釈しています。 一般的に「DNAを低濃度で保存するのは良くない」と教わってきたので、 高度に希釈したスタンダードを保存したら定量的な実験にはならないだろうと当然のように思っていました （ちなみに「良くない」理由は主に凍結融解の際の分解なのだと感じていましたが、このスレでの議論を見ていると吸着もあるのかもしれませんね）。 低濃度保存では濃度が低下しやすいものだと思っていたので、 ＞それは、一度はうまく希釈された（等間隔になった）スタンダード溶液でさえ、数日後にランしてみると、今度は間隔がバラバラになったり、あるいは各濃度のスタンダードの増幅曲線が全体的に右にシフトする（＝全体的に増幅が遅くなる；あたかも各スタンダード溶液の濃度が下がったかのように）ことがあるのです。 「間隔がバラバラになる」「増幅曲線が全体的に右にシフトする」のは当たり前に思えるのですが、一つ質問です。 頻繁にリアルタイムPCR定量を行う人は、普通は、段階希釈したスタンダードサンプルって保存するんですか？ その際は、凍結融解をさけるために冷蔵保存？あるいは冷凍保存？ 熟練の方々の意見を聞かせてもらえれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.294-6 - 2007/10/07 (日) 00:46:56 - りあるたいむ APさん、レスありがとうございます。 > ピペットチップやチューブに吸着するからではないでしょうか。 > 吸着のしやすさはブランドやグレード、ひょっとするとロットによってちがうでしょうから、同じようにやってコンスタントな結果にならないこともありえます。 なるほど、吸着ですか。確かにそれが本当ならば、私が今困っている現象が説明できますね。リアルタイムRT-PCR時に用いるプライマー溶液などは、約40ng/μlなどというように比較的濃い溶液を用いているので吸着したとしてもそれほど影響が出ないが、スタンダード溶液（1pg/μl以下の段階希釈）では吸着の影響が無視できなくなってくるということですね。 実は、段階希釈したスタンダードサンプルが等間隔にならないという問題以外にももう一つ困っていることがあります。それは、一度はうまく希釈された（等間隔になった）スタンダード溶液でさえ、数日後にランしてみると、今度は間隔がバラバラになったり、あるいは各濃度のスタンダードの増幅曲線が全体的に右にシフトする（＝全体的に増幅が遅くなる；あたかも各スタンダード溶液の濃度が下がったかのように）ことがあるのです。この件も、スタンダード溶液を保存しているチューブへの吸着を想定すると説明がつくかもしれません。保存（凍結・融解を含む）している間に吸着の度合いが変化し、そのためうまくいくときといかないときが生じると考えました。 だとしたら、スタンダードサンプルはキャリアDNA溶液で段階希釈したり、また吸着しにくいようなシリコナイズされたチューブを使うなどしてみたいと思います。ただこれらはお金のかかることなので、もしその前に試せることがあれば試したいのですが…　例えばサンプルチューブを保存しているチューブへの吸着を考えた場合、この吸着というのは何らかの操作ではがせるものなのでしょうか？　通常凍結保存してあったサンプルを使用する前に行うボルテックス（20秒くらい？）では、効果はなさそうでした。。。

(無題) 削除/引用 No.294-5 - 2007/10/06 (土) 16:10:57 - AP ピペットチップやチューブに吸着するからではないでしょうか。 吸着のしやすさはブランドやグレード、ひょっとするとロットによってちがうでしょうから、同じようにやってコンスタントな結果にならないこともありえます。 面積あたりどれくらい吸着するかというのは、ある程度の濃度以上だと飽和して一定だとすれば、その濃度以上では吸着によるロスを除けば、標準液の濃度は比例的に変化する。液中のDNAが吸着を飽和させるに至らない量以下だと、濃度依存的に吸着量が変わり、希釈列の描く検量線の相が変わる、ということを想像します。ピペットの誤差を少なくするために液量を増やしたとしても、そのぶん接触する壁面積も増えてくるので、これの影響は免れないと思います。 これは、リアルタイムPCR以前にもドットブロットなんかでもあったことですが、結局、標準DNAの濃度の変化が全体のDNA量の変化に与えるインパクトが無視できるくらい大過剰のキャリアを含む希釈液を使うのが良いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.294-3 - 2007/10/06 (土) 15:09:02 - りあるたいむ レスありがとうございます。 > TakaraがcDNAなどの希釈系列を正確に作るためのbufferを > 最近販売し始めたので、同じような問題を企業なども気が付いていたようです。 確かに、すごく薄いスタンダードの域（10コピーや100コピーなど）では希釈が不安定になりやすいのでシャケ精子などのキャリアDNA溶液で希釈したりしますよね。TaKaRaのその製品の場合はキャリアDNAというわけではなさそうですが…。 ただ、10^5コピーや10^6コピーといった比較的濃い領域でも、段階希釈がうまくいかないということもあり得るのでしょうか？（現に私はその件で困っているのですが…） > おそらく今までは希釈してたときのbufferを水やTEなどで行ってたのが > いけなかったのかなあと思ってます。 通りすがりさんの場合は、TaKaRaの製品を用いたら段階希釈が正確になったということでしょうか？　また、そうだとしたらどれくらいの濃度のスタンダードを用いていたのでしょうか？　よろしければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.294-2 - 2007/10/06 (土) 07:41:03 - 通りすがり それはおきますね、たしかに。 以前から同様の問題に自分も気づいてましたが 本当の原因はいまだによくわかりませんが、ただ TakaraがcDNAなどの希釈系列を正確に作るためのbufferを 最近販売し始めたので、同じような問題を企業なども気が付いていたようです。 おそらく今までは希釈してたときのbufferを水やTEなどで行ってたのが いけなかったのかなあと思ってます。 ↓ Easy dilution(1 ml×8 ￥10,000) http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100005168

段階希釈がうまくいきません 削除/引用 No.294-1 - 2007/10/06 (土) 02:35:27 - りあるたいむ リアルタイムPCRで絶対定量を行うべく、注目したいmRNAを逆転写→cDNAをPCR→これを段階希釈してスタンダードとしています。希釈系列は10倍ごとです（10^8コピー，10^7コピー，10^6コピー，10^5コピー…）。 ちゃんと10倍ごとに希釈されていれば、それぞれのスタンダードサンプルの増幅曲線は等間隔に立ち上がっていくはずですが、現状では間隔がバラバラになってしまいます。（例えば10^5スタンダードと10^6スタンダードの間が妙に開く、など。）ピペッティングエラーが出にくいよう、希釈するときはできるだけラージスケールで行っているので、希釈時の操作ミスとは思えません。 また、ラボに昔から存在していた実績のあるプライマー・スタンダードセットを用いてリアルタイムPCRをすると、ちゃんと希釈段階に応じた間隔で増幅曲線が立ち上がるので、機械自体のトラブルではないと考えております。 ぶっちゃけ、”ただ薄めるだけ”という操作なので、どこに問題が生じているのかさっぱり検討がつかず、困り果てています。どなたかお力添えをお願いします。

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