いつも参考にさせて頂いています。
フローサイトメーター初心者です。
現在ある微生物をフローサイトメーターで解析しており、あるタンパク質を膜に発現してるものとしていないものの比率を算出しようと実験を行っております。微生物を核染色(PI）で、タンパク質をFITC標識抗体で染色しています。
PIポジティブなものにゲートをかけて、その群衆の中でFITCポジティブとネガティブの比率を出したいと思っています。
しかし、一つ問題がありまして、FITCの蛍光が弱すぎるのか、発現蛋白の量が少なすぎるのか、群衆が完全に二つには分かれてくれません。ヒストグラムが完全に別の２つの山になってはくれず、ヒストグラムの山の裾野がかなりかぶっているような感じになってしまいます。ドットプロットで見てもクリアな２群衆にはなっておらず、正しい比率が非常に算出しにくい状態になっております。
同じようなことをしている論文を見ますと、やはり同じ現象が起こることがあるようで、Isotype Controlで染めたサンプルを解析し、その後、特異的抗体で染めたサンプルを解析し、それぞれのデータをソフトウェア上で解析しネガティブの群衆をサブトラクションしてポジティブの群衆の比率を求めています。
しかしながら、私共の研究室にはそのようなことが出来るソフトが無く、その方法自体が正しい比率を算出しているのか疑問を持っております。
そこで、私としては抗体のF/P ratioをもっと上げてやるか、それとは別の方法で蛍光強度をあげてやれば、ポジティブとネガティブの群衆がもっと分けやすくなるのではないかと考えております。手持ちの抗体のF/P ratioを上げる方法をもしご存知でしたら教えて下さい(再度FITCラベルを行う？）。また、蛍光強度を上げる術の一つとして、２次抗体を使用するというのは反則なのでしょうか？つまりFITCラベルされた抗体（１次抗体）で微生物の膜タンパク質を染色し、さらにその上からFITCラベルされた抗１次抗体（２次抗体）を使用してFITCの蛍光強度を上げるという感じのことが出来ないのでしょうか？
まだフローサイトメーターを始めたばかりで、かなりわかりにくい説明だとは思いますが、ご意見をお聞かせ頂きたいです。 |
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