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(無題) 削除/引用 No.287-4 - 2007/10/08 (月) 15:45:44 - a VP-tagではなく目的部分の抗体では試されましたか？ サンプルバッファーに還元剤は加えていますか？熱変性はしていますか？ リン酸化などでもバンドがシフトすることもありますが・・・ 私が経験したことですが、 以前同様の現象が起きた時、N末,C末両方に異なったtagを付け検証したところ、目的の蛋白質のC末が分解を受け易いことが分かりました。細胞を溶かした時というよりは、細胞内で既に分解を受けてるのかも知れません。 結局、分解を受けなかったもの（C末タグを持つもの）でIPしました。ただ、内在性のものではそのような分解はなさそうなので、本当に立体構造が正常にとれているのかなあ？と今でも疑問に思っています。 的確なアドバイスはできませんが、余裕があれば異なったタグのベクターに変えてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.287-3 - 2007/10/05 (金) 18:59:09 - 初心者 回答ありがとうございます。 ベクターだけをトランスフェクションした際は、バンドは1本しか確認できません。 LYSIS BUFFERには、カクテルのプロテアーゼ阻害剤(シグマ)を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.287-2 - 2007/10/05 (金) 18:35:06 - a このバンドはベクターのみのトランスフェクションでも出ますか？ もし検出できないのなら、vp16-tagged protein由来の蛋白質ということですが、分解とか修飾を受けた産物かも知れません。lysateにするときプロテアーゼ阻害剤は入れていますか？

融合タンパク発現での不具合 削除/引用 No.287-1 - 2007/10/04 (木) 19:05:50 - 初心者 現在pull-downを行うために、fusionタンパクを作っています。 あるfusionタンパクにおいて、細胞抽出液中での発現を確認するためウエスタンをしたところ、バンドのすぐ下に同じ濃さのバンドが検出されてしまいます。 バックは非常に奇麗にので、非特異的な結合ではないだろうと思っています。 ベクターのコンタミの可能性も考えられたので、新しいクローン取り直しても同じ結果となりました。 この現象はどうして生じるのか？ その対処方法があれば、教えてください。 よろしくお願いします。 現在の条件 100mmシャーレ 使用している細胞：cos7 vp16-tagged protein トランスフェクション:5μg

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