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ありがとうございました 削除/引用 No.284-9 - 2007/10/17 (水) 10:53:38 - MI 皆様のアドバイスのおかげで、FLAGを検出する事ができました。 他の先生から、強制発現させたCell Lysateを頂き、泳動したところ きれいな像が得られました。 どうやら、私が培養している細胞の発現が落ちてきているため、 最近のLysateでは、検出できなかったようです。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.284-8 - 2007/10/06 (土) 14:12:59 - ats 私もAPさんの意見に賛成です。 ニトロセルロ−ス膜ではなくPVDF膜を使い、最近の実績のあるポジコンを使うことをお勧めします。 ニトロセルロ−ス膜はPVDF膜に比べて面積あたりの保持できるタンパク総量が少なく、まれにほとんど結合しないタンパクもあると聞きました。

(無題) 削除/引用 No.284-7 - 2007/10/05 (金) 15:02:54 - AP 他の方も書かれているとおり、anti-FLAG M2は難しいところのない抗体です。 おそらく、抗体の問題ではないと思います。コントロール用に売られているFLAG-BAPでポジコンとれば一発ではっきりしますが。 ひとつ気になるのは、ターゲットが12 kDと小さいこと、にもかかわらずニトロセルロース膜にブロットしていることで、これは条件によっては容易にタンパク質が通り抜けると思います。前任の人とブロットの条件も一緒でしょうか？ バッファーの組成がちょっとずれていたり、ゲルの前処理の違い（トランスファーバッファーに十分平衡化するか、それをスキップするか）なんかでもだいぶ結果が違うことがあります。そのサイズだと、PVDF膜を使うのがmustではないかしら。

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.284-6 - 2007/10/05 (金) 13:52:18 - Y ポジコンにセレクションをかけた際にとったサンプルとありますが、 transformantのcell lysateのことなのでしょうか。 そもそも、ウェスタンで検出しようとしているサンプルはどんなものなのでしょうか。強制発現させたcell lysateですか、transformantでしょうか。それとも精製タンパクなのですか。その辺の情報が無いと、良いアドバイスがもらえないのではないでしょうか。 さて、セレクションをかけた際にとったサンプルをポジコンとしているということですが、これがtransformant cellを意味しているのでしたら、 細胞培養の際に適切な薬剤はちゃんと入れていますか。 stable lineを確立する際、stable になったlineでも薬剤を抜いてしばらくすると、その発現が著しく落ちる場合があります。もし強制発現系で検出されないのならば、検討する箇所はたくさんあると思います。（そもそもコンストラクトに問題はないか、トランスフェクションはちゃんと出来ているか、用いる細胞を変えてみてはどうか等）

(無題) 削除/引用 No.284-5 - 2007/10/05 (金) 10:52:24 - モノクロ FLAGタンパクのポジコンとして、過去の人のサンプルは心もとない気がします。FLAG-BAP等をSIGMAから購入するか、周りの方にFLAGリコンビナントを分けてもらった方がいいと思います。ちなみに、私はトランスフェクタントを流し、抗FLAG-M2 2万倍希釈、抗マウスIg-HRP 4万倍希釈でノンスペのないきれいな像が得られております。Ｍ２抗体はかなり使えるという認識です。

現状は 削除/引用 No.284-4 - 2007/10/05 (金) 09:51:34 - MI ats様、ご指導ありがとうございます。 以下に私がわかる範囲で記載致します。 電気泳動は問題ないのか？ ブロッティングは成功しているのか？ →Reprobeして、別の抗体で染めたらバンドがでるので大丈夫だと思います。 どのようなタンパクを検出しようとしているのか（最低でも材料、分子量）？ →グルタレドキシン1 (GRX1)で、分子量は12KDaです。 ポジコンは何？ →セレクションをかけた際に取った保存Sampleです。その時は、バンドが見えたそうです。 WBのプロトコ−ルは？（サンプル処理は？ゲルは市販か否か？マ−カ−は？セミドライ？PVDF膜？ブロッキング剤は？抗体濃度は？発色or発光？） →Lysis Buffer（含 グリセロール）にてLysisし、自分で作成した15%Gelを使用しています。マーカーはBioLabsのP7708Sを使用しています。 Sampleは、20μg/wellでアプライしています。 セミドライでニトロセルロース膜。 ブロッキング剤は、5% Skim Milk in TBS-Tween20(0.10%)です。 抗体は1st Ab 1/2000で、2nd Ab 1/2000で使用し、発色はECLです。 セレクションをかけたのは前任者で、プロトコールが残っていません。 私が他の抗体をIBする時のプロトコールでやってみました。 この他に、Skim Milkの濃度を下げたり、Tween20の濃度を下げたり、 TOYOBO Can Get Signalを使用したりと試行錯誤したのですが、 うまくいきません。 知識が足りない上に分かりにくい文章で、ご迷惑をお掛けしますが、 助けて頂けると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.284-3 - 2007/10/04 (木) 18:24:57 - ats もっと情報をいただけないと答えようがありません。 冷たいようですが、さっさと試薬を作り直してやり直せ、となります。 お近くに教えを請う方はいないのでしょうか。 各メ−カ−HPにもWBのprotocolは載っていますがお読みになりましたか？ 実験がうまく行かない時の打開策の基本は、各ステップでの確認です。 質問レベル＝理解（思考）レベルと取られます。匿名だからといって気を抜かないで。 焦らずじっくり考え文章を練りましょう。（偉そうですいません） さて、 電気泳動は問題ないのか？ブロッティングは成功しているのか？ それが問題なさそうなら、 どのようなタンパクを検出しようとしているのか（最低でも材料、分子量）？ ポジコンは何？ WBのプロトコ−ルは？（サンプル処理は？ゲルは市販か否か？マ−カ−は？セミドライ？PVDF膜？ブロッキング剤は？抗体濃度は？発色or発光？） くらいは、教えてください。

(無題) 削除/引用 No.284-2 - 2007/10/04 (木) 17:47:13 - 通りすがり とりあえず今お使いのプロトコルを示してください。 ポジコンには何をお使いでしょうか。

FLAG M2 削除/引用 No.284-1 - 2007/10/04 (木) 16:09:33 - MI いつも、このフォーラムで勉強させて頂いています。 FLAG M2というSigmaの抗体を使用してWBをしているのですが、 目的のバンドが出てきません。 ポジコンでも何も出てこなくて、困っています。 どなたか、プロトコールを御教示頂けると嬉しいです。

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