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(無題) 削除/引用 No.2817-9 - 2009/02/07 (土) 21:29:09 - A サンプル量が少ないものからイミダゾールを抜くだけならAmiconから 出ているCentricoなりMicroconなりでバッファー交換するのも手です。 ただ限外ろ過ですから膜付近でタンパク濃度が濃くなりますからもし 高濃度でアグリゲーションを起こしやすいタンパクなら（DNA polymerase を扱ったことが無いので私はわかりませんが）遠心5-10分ごとに ピペティングして攪拌することをお勧めします。元の体積を10倍ぐらいに 濃縮して交換するバッファーで元の体積に戻すという操作を3-4やれば 十分だと思います。もしそれほど濃縮できないのであれば操作の回数 を稼いでバッファー交換してください。

(無題) 削除/引用 No.2817-8 - 2009/02/07 (土) 16:36:28 - おお もし、保存中に悪くなっているのであれば、 やり直しですよね。その可能性が否定できない のであれば、活性を測ってとか透析したりとか あまり意味がないのでは、まずは不安材料を ひとつ取り除くために大腸菌を培養して 精製しなおしたほうがいいのではないでしょうか。 それとイミダゾールがじゃまというのなら、 Niのカラムから酸性で溶出というてもあります。 燐酸バッファーであれば燐酸のバランスを調整すれば pHはかえれますし、反応溶液に混ぜるのであれば 希釈率がじゅうぶんであればpHを気にする必要はないです。 ちなみにわたしはHis タグのタンパクをPIPES pH 6.4で 溶出したことがあります。 あと文献を当たることを強くおすすめします。

皆様、ありがとうございます 削除/引用 No.2817-7 - 2009/02/07 (土) 15:26:11 - messi じつは、一度ポリメラーゼ活性は測ってみました。 が、活性がまったく見られませんでした。 SDS-PAGEで確認したところ、リーズナブルな位置にバンドが 確認できています。 なので、分解していることは考えられず、正しい立体構造をとれていないのかもと・・・。 調べてみたらイミダゾールが含まれているとHisに結合することで立体構造がおかしくなるとか、アミノ酸と結合して水の場合とは異なる水素結合を形成してしまうため活性サイトがつぶれてしまうなどの知見があったので、活性が得られなかったのはイミダゾールのせい・・・と淡い期待を抱いている感じです。 加えて、サンプル量が少ないので無意味に透析をすることは避けたく、何が一番有効な方法か質問させていただきました。 とにかく透析してみるのが一番でしょうか・・・。

(無題) 削除/引用 No.2817-6 - 2009/02/07 (土) 13:01:27 - おお イミダゾール存在下で安定に保存できたというたんぱく質も あります。その場合は除くとあまり安定でなかった ということです。 DNA polであればリコンビナントを精製した文献はかなり あるのではないでしょうか。 いちど、SDS-PAGEをして、分解していないかと、 活性を測って、遜色ない活性があるか見てみるだけで 十分でないでしょうか。 リフォールディングとおっしゃいますが、 変性条件で抽出、精製してなければ、 正しくフォールディングしている可能性 もありますし、イミダゾールは変性剤では ありません。 くわえて、アッセイ系がイミダゾールを 含んでいても大丈夫か大丈夫なくらい うすめれるのであれば、イミダゾールを 抜く作業はそんなに重要とはおもえません。

(無題) 削除/引用 No.2817-5 - 2009/02/07 (土) 02:50:46 - A 書いていて当たり前すぎでいまさらですが、、、。 どの様なデータが欲しいのかわかりませんがもし活性の有無がわかればいいつまり定性的なデータで十分なのであればとにかく透析でイミダゾールを 抜いて計って活性があれば少なくとも1ヶ月前にも活性はあっただろうとは いえるはずです（もちろん稀に冷蔵庫に長期保存しておいたためにある種のリフォールディング効果があるらしく精製直後よりも活性があったという話 を聞いたこともあります）。 もし定量的なデータが欲しいのであればたとえば他のデータとの活性を 比べるためのコントロールサンプルが必要になるはずですからそれがあるの であれば現在の活性がどれほどなのか確認して他のデータと比べられる はずです。もちろんこの場合、精製直後の活性を反映している保障はあり ません。

(無題) 削除/引用 No.2817-4 - 2009/02/07 (土) 02:18:59 - 名無し こればかりはもうやってみないことには誰にも何とも。

(無題) 削除/引用 No.2817-3 - 2009/02/07 (土) 00:31:01 - messi ＞二等兵様 ありがとうございます。 タンパク質の種類によって、全く異なるということでしょうか？ イミダゾールの影響を強く受けるものもあれば、大丈夫なものもあるという理解でよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2817-2 - 2009/02/07 (土) 00:01:15 - 二等兵 ケース・バイ・ケースですので、これだけの情報からは何とも言えません。

組み換えタンパク質の立体構造 削除/引用 No.2817-1 - 2009/02/06 (金) 23:06:24 - messi 大腸菌で発現させた組み換えタンパク質（DNA polymerase)をHis-tag精製し、イミダゾール溶液(0.5M)で溶出してきました。 その後、このタンパク質を透析せずにイミダゾール溶液のまま、1ヶ月ちかく保存（おそらく-80℃）していました。 今になって、このタンパク質の酵素活性を測りたいのですが、これから透析なりrefoldingをするなりの作業でタンパク質の立体構造は正しく戻るものでしょうか？ 実は、タンパク質の保存状態がどのようなものであったのか把握できておらず、4℃保存で1ヶ月近くたってしまっている可能性もあります。 この状態のタンパク質は使えるものでしょうか？ アドバイスよろしくお願いいたします。

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