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(無題) 削除/引用 No.2815-9 - 2009/02/09 (月) 19:44:14 - A >[Re:7] Ureaさんは書きました : > Ureaでなくグアニジンで溶解させた蛋白の場合も、ボイルは避けた方がよいのでしょうか？これもUreaと同様SDS-PAGEであれば問題なくwesternで影響がでるのでしょうか？ グアニジンの入っているサンプルをSDS-PAGEにのせると私の記憶が確か ならのせた瞬間に赤くなって浮いてきてしまったはずです。ですから グアニジンでサンプルを変性させた場合はNi2+カラムにのせるまでは グアニジンのバッファー系を使ってWash以降は8MUreaのバッファー系に してカラム上でバッファー交換の様な操作を行なうといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2815-8 - 2009/02/09 (月) 16:57:29 - EcoRI グアニジンとSDSは不溶性の塩を作りますので、 グアニジンを含むサンプルはSDS-PAGEにかけられません。 グアニジンとSDSの不溶性の塩は５５度ぐらいで溶けるようですが…

(無題) 削除/引用 No.2815-7 - 2009/02/09 (月) 16:35:38 - Urea Ureaでなくグアニジンで溶解させた蛋白の場合も、ボイルは避けた方がよいのでしょうか？これもUreaと同様SDS-PAGEであれば問題なくwesternで影響がでるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2815-6 - 2009/02/08 (日) 18:49:32 - EcoRI おそらく、SDS-PAGE & CBB stainならばそれほど影響は無いのだと思います。 カルバミル化で増えるのはおよそ40Daなので、kDaレベルのタンパク質の分子量にとって誤差範囲になってしまうからでしょう。 ただし、正電荷や質量が負荷されてしまうので、 IEF-SDS-PAGEやMS/MSではかなりクリティカルなのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2815-5 - 2009/02/07 (土) 03:11:38 - A EcoRIさん >溶かすときは、体温で溶かすのはNGで、できればon iceがいいと思います。 私は大腸菌のwhole lysateを得て発現確認する時に用事調整で早く溶かすために37度の恒温層にいれていますが問題になるかもしれないというですね？ まあ私の場合ははシグナルの有無しか見ていませんからあまりきにして いませんが。 Ureaさん >追加の質問なのですが、このUreaで溶出したHisタグタンパクを、 >そのまま-80℃で保存することは可能ですか？それともふさわしい保存温度 >がありましたらご教示お願いします。 これはその後の目的によると思います。私のところではあるHis-tagを付けた リコンビナントタンパク質を8MUrea入りで大量に精製したものをWBでポジコンと して使っています。この場合、8MUreaが入ったままで凍結して-80℃で保存し、1年以上使っていますがシグナルの強度が変わった印象はありません。 ただ、EcoRIさんがおっしゃっているように保存中でもカルバミル化が いくらかでも起る可能性がありますから出来るかぎり早く抜いてしまうに 越したことはないと思います。 それから念のためですがCBBで見る程度であれば煮沸してもそれほど問題に ならないと思いますが通常Ureaの入ってサンプルは煮沸しない方が安全です。 特に私のようにWBの場合は煮沸でエピトープが変わってしまって抗体が 認識できなることがありますので厳禁です。あとUreaが入っていると 塩濃度の影響だと思いますがSDS-PAGEでの泳動距離が入っていないものと 違うのがはっきりわかります。ですから何らかのコントロールとバンドの 位置が同じなのか比べたい場合はコントロールにもUreaを入れて泳動する 必要があります。

(無題) 削除/引用 No.2815-4 - 2009/02/07 (土) 00:11:28 - Urea 追加の質問なのですが、このUreaで溶出したHisタグタンパクを、そのまま-80℃で保存することは可能ですか？それともふさわしい保存温度がありましたらご教示お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2815-3 - 2009/02/06 (金) 18:03:13 - EcoRI Ureaはくせ者です。 ななしさんのおっしゃることにはほぼ酸性です。 SDS-PAGEでは問題にならないと思いますが、2D-IEF-SDS-PAGEなんかでは、 ureaの分解物由来のカルバミル化によって、１つのタンパク質から複数のスポットが検出されるので、取扱いは要注意です。 Urea溶液の保存方法ですが、 溶かしたら、１回で使い切れる量の小分けにして、 すぐに-80度で凍結すれば１週間は持ちます。 (2Dで影響なし、MS/MSしたら、カルバミル化がおきてました…) (A社の言う通り４度で保存してたら、それはもうひどいことに…) …やっぱり、用事調製がいいかも。 溶かすときは、体温で溶かすのはNGで、できればon iceがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2815-2 - 2009/02/06 (金) 17:33:47 - 名無し 精製した蛋白質について翻訳後修飾のような詳細な構造解析やN末シーケンシング等を予定しているならboilしないほうがいいと思う。ボイルで生じたUreaの分解物とかによって、リジンとかのアミノ酸側鎖がカルバミル化（だったとおもう。一応調べてみてください）される場合があるので気をつけましょう、と本に書いてあるのを昔、読んだ。ureaは分解するとアンモニアみたのが出来てpHも上がると思う。古いUreaを使ったときも同じような問題がおこるらしい。いままでボイルしたのとしないのとを並べてSDSPAGEしてみたことが何回かあるけど、パタン的には見分けつかないくらい同じだったから大抵の場合はboilingの意味は小さいのだと思う。習慣的にboil はしない主義の先生もいた。（ただIgGはボイルしないとS-Sが完全に切れなくて70KDaとか150KDaとかにH-Lらしい変なバンドが出たりしたのでIgGf含むやつのときはちゃんと煮ることにした） 昔はUreaはまず精製して不純物のぞいてから使ってたと先生に聞いたことがある。いずれにせよ蛋白質の実験につかうUreaはきるだけハイグレードのやつがいい。また面倒でもurea溶液は用事調製がいい。

Ureaを用いたHisタグ蛋白の溶出 削除/引用 No.2815-1 - 2009/02/06 (金) 17:06:12 - Urea 　現在Ni-NTA Agaroseを用いてバッチ法でdenature cinditionでたんぱく精製を行っています。 溶出にUreaを用いています。その後、この溶出したサンプルをＳＤＳ-Pageでチェックしたいのですが、この場合 このUreaで溶出したサンプルとサンプルバッファーを混合した後ボイルは必要なのでしょうか？それともUreaが入っているのでボイルしない方がよいのでしょうか？ 　ご教示お願い致します。

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